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张坤: 作品数：24 被引量：42H指数：3; 供职机构：扬州大学园艺与植物保护学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金江苏省自然科学基金江苏省高校自然科学研究项目更多>>; 相关领域：农业科学化学工程更多>>

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本氏烟转录因子bZIP60多克隆抗血清的制备及其应用: 2021年; 【背景和目的】植物未折叠蛋白应答(Unfolded protein response,UPR)信号通路在植物生长发育调控、逆境胁迫应答、内质网压力缓解等过程中起到重要作用,其中的bZIP60蛋白在该通路中起到关键核心作用。为了检测本氏烟UPR机制中bZIP60蛋白的表达,制备其抗血清用以探究其生物学功能。【方法】通过RT-PCR方法从本氏烟中克隆了bZIP60基因,然后将该基因连接至原核表达载体pET28a上,导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经1 mM IPTG诱导表达分子量约35 kDa的融合蛋白,用Ni-NTA亲和柱纯化获得靶标蛋白。最后以纯化的bZIP60蛋白辅以佐剂皮下免疫新西兰大白兔制备抗血清。【结果】Western blot分析表明,制备的抗血清具有较好的特异性和灵敏度,可以特异性检测到由喷施DTT引起本氏烟中bZIP60蛋白的表达。【结论】本研究通过原核表达技术成功获得融合His标签的bZIP60重组蛋白并制备了相应的抗血清,为下一步深入探究病原物与植物互作中bZIP60的分子机理提供研究基础。; 张浩庄新建郭枭徐红梅贺振张坤; 关键词：原核表达抗血清制备

中国常见水稻病毒病鉴定方法研究进展被引量：8: 2020年; 水稻是我国主要的粮食作物之一,其生长发育经常受到各种病虫害的影响。其中,水稻病毒病经常造成水稻的严重减产甚至绝收,而水稻病毒病的防治主要是通过筛选高抗品种,但是筛选高抗品种的过程比较复杂,要及时检测田间水稻和介体昆虫的带毒情况,并且应尽早清理发病的水稻植株,灭杀田间介体昆虫来降低病毒危害。因此,快速、灵敏、简便、准确的检测水稻病毒和介体昆虫带毒情况对预测病害的流行与病害防治非常重要。通过对已发表文章中水稻病毒病的发病症状、病毒粒子形态及检测方法进行了整理、归纳和总结,从而让广大植保工作者能在田间快速准确地识别病毒病害,并能迅速采用相应的方法进行简单快捷的检测。该研究对水稻病毒病的预测预报、田间防控提供了科学依据。; 庄新建徐红梅甘海峰贺振刘芳张坤; 关键词：水稻病毒病症状分子检测免疫学检测

雀麦花叶病毒外壳蛋白基因原核表达及抗血清制备被引量：3: 2020年; 雀麦花叶病毒(brome mosaic virus,BMV)为正义单链RNA病毒。BMV寄主范围广泛,在波兰等地均有发现(Trzmiel et al.,2015),大多危害禾本科、豆科、茄科等植物,感病植株常表现出褪绿、轻微花叶症状。因此,为减轻BMV造成的经济损失和丰富BMV的检测方式,本研究拟构建BMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因的原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中表达BMV的外壳蛋白,制备高特异性和高灵敏度的抗血清,以期用于BMV的有效检测与防治。; 贺振甘海锋陈雯陈夕军张坤; 关键词：雀麦花叶病毒外壳蛋白抗血清制备寄主范围花叶高特异性

扬州蚕豆病毒病的鉴定及野豌豆潜隐病毒M扬州分离物基因组克隆及其序列分析被引量：3: 2020年; 对田间疑似病毒侵染的蚕豆样品,提取总RNA,分离siRNA,建库并通过高通量测序,其结果经velvet拼接组装,经Blastn与NCBI比对分析,发现该样品感染4种病毒:野豌豆潜隐病毒M (vicia cryptic virus M,VCV-M)、野豌豆潜隐病毒(vicia cryptic virus, VCV)、紫云英矮宿病毒(milk vetch dwarf virus, MDV)和三叶草黄脉病毒(clover yellow vein virus, ClYVV)。其中,有14条VCV-M相关的contigs。RT-PCR扩增并拼接获得VCV-M-YZ基因组,其长度为3 434 nt,其5′-UTR和3′-UTR分别为142 nt和117 nt,各自形成与该属代表病毒南方番茄病毒(southern tomato virus, STV) 5′-UTR和3′-UTR相似的高级结构,且A+U含量均较高。VCV-M-YZ与已报道的VCV-M基因组序列一致性在98%以上。系统进化分析表明,VCV-M-YZ与已报道的VCV-M属于一个种,无明显的地理分布差异。本研究结果丰富了VCV-M群体的基因组遗传信息,为VCV-M的监测及深入研究提供了基础。; 张坤徐红梅臧颖庄新建甘海峰陈雯贺振; 关键词：核苷酸

江苏省扬州市水仙病毒检测鉴定与序列分析被引量：2: 2019年; 水仙属于石蒜科水仙属,是重要的观赏花卉之一。2016年-2017年,在江苏省扬州市采集的水仙上发现典型的花叶、条斑等病毒病症状。利用已报道的水仙病毒通用引物对疑似病样进行RT-PCR检测,结果表明,扬州采集到的3份病样上均能扩增到与预期大小相同的DNA片段。经克隆测序和序列分析发现,所得序列包含3种不同的类型,分别与水仙普通潜隐病毒Narcissus common latent virus(NCLV)、水仙退化病毒Narcissus degeneration virus(NDV)和水仙黄条病毒Narcissus yellow stripe virus(NYSV)有93%、98%和99%的相似性,表明江苏水仙受到了NCLV、NDV、NYSV 3种病毒侵染。这是江苏水仙上第一次发现NCLV、NDV、NYSV。在系统树中,NCLV可分为两个组,本研究所得NCLV-YZ与上海分离物位于同一组中;NDV也可分为两个组,本研究所得NDV与其他中国分离物均位于第二组;而NYSV具有很高的多样性,可分为4个组,本研究所得NYSV与其他部分中国分离物和日本分离物位于第一组。NCLV和NDV分组具有清晰的地理差异性,而NYSV受到地理隔离的影响不明显。; 张坤陈雯甘海峰罗云建陈夕军贺振

河南温县地黄上瓜类褪绿黄化病毒的鉴定及其CP序列分析被引量：6: 2022年; 0引言地黄(Rehmannia glutinosa Libosch.)为玄参科(Scrophulariaceae)多年生草本植物,根部为传统中药材,主要产区分布在山东、山西、河南、河北、北京等地。地黄栽培中通常使用块根进行无性繁殖,易导致病毒病积累发生,从而严重影响地黄的产量与质量[1]。目前侵染地黄的植物病毒主要有烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)、地黄花叶病毒(rehmannia mosaic virus,ReMV)、油菜花叶病毒(youcai mosaic virus,YoMV)、蚕豆萎蔫病毒2号(broad bean wilt virus 2,BBWV2)、车前草花叶病毒(plantago asiatica mosaic virus,P1AMV)等[2]。; 庄新建郭枭丁诗文董卓倬贺振张坤; 关键词：烟草花叶病毒植物病毒多年生草本植物地黄无性繁殖

雀麦花叶病毒外壳蛋白基因原核表达及抗血清制备: 雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV)寄主范围广泛,多为害禾本科、豆科等植物,因此,建立快速有效的检测方法对于BMV的防控有着重要意义。本研究依据BMV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因...; 甘海锋陈雯陈夕军张坤贺振; 关键词：雀麦花叶病毒外壳蛋白原核表达抗血清; 文献传递

凤仙花坏死斑病毒NP基因原核表达及抗血清制备: 2024年; 凤仙花坏死斑病毒(impatiens necrotic spot virus,INSV)可引起多种农业和园艺观赏作物的严重病害,该病害在世界范围内普遍发生,建立快速有效的检测方法对INSV的防控有着重要意义。以INSV Nuclear Protein基因序列引物进行扩增,获得789 bp的目的基因,将其与原核表达载体pET28a连接,获得重组质粒pET28a-NPINSV,将其转化大肠埃希菌Rosetta菌株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测显示在分子量约28.7 ku处有目的蛋白质条带,与预期的INSV NP大小一致。利用镍柱亲和纯化INSV NP蛋白,并免疫健康新西兰大白兔,制备兔多克隆抗血清。通过Dot blot和ELISA方法对INSV NP多克隆抗血清进行检测,结果显示其能特异性识别INSV的NP蛋白。应用此抗血清在受INSV侵染的桃叶样品中能检测到NP蛋白的表达,而在健康植株叶片中未检测到。对制备的抗血清用纯水稀释至1:20000时,仍能特异地检测到目的蛋白质条带,说明该抗血清特异性较强,效价较高,可为INSV的快速检测提供有效的方法参考。; 蒋润州纪开燕赵海婷丁诗文秦朗张坤赵景奎贺振; 关键词：凤仙花坏死斑病毒 NP蛋白原核表达抗血清

RSV-寄主-介体三者间相互作用研究进展被引量：1: 2019年; 为了解国内外关于水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)-寄主-介体三者间互作关系的研究现状,采用文献检索的方法,对研究结果进行总结和比较分析。结果表明:1)RSV自身编码蛋白间存在着较为复杂的直接互作,从而保证了病毒生命过程的有序衔接。2)RSV与寄主水稻及介体灰飞虱间的间接互作,大多与病毒造成的在植物上症状,病毒经介体卵传播等特点相吻合。3)RSV编码蛋白与介体因子间的直接互作,参与了病毒在介体中的复制,传播及抵御介体免疫等生命过程。4) RSV-寄主-介体三者间互作关系的研究已成为领域内的研究热点,国内每年高水平研究论文不断涌现。针对RSV-介体互作研究中病毒与介体遗传体系均不成熟的现状,提出以下的解决方案:加快RSV全长侵染性cDNA克隆的构建或者RSV微小复制子的构建;另外可以对现有的CRISPR/Cas9技术进行优化,尽快实现对灰飞虱进行高通量的基因敲除。; 张坤徐红梅张定谅贺振刘芳; 关键词：水稻条纹病毒 SIRNA

地黄花叶病毒河南分离物检测鉴定及其MP序列分析被引量：2: 2022年; 2019年夏,在河南温县中草药园内发现种植的地黄呈现疑似病毒侵染所表现出的褪绿、花叶等症状,采集该样品,用Trizol法提取地黄样品总RNA,分离其siRNA,并进行文库构建和siRNA高通量测序。将测序结果经接头去除、拼接组装后(Velvet Software 0.7.31,k=17),与NCBI数据库中序列进行核酸比对分析,发现该样品中存在着地黄花叶病毒(Rehmannia mosaic virus,ReMV)和瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)的部分片段。通过RT-PCR确认该样品存在ReMV的侵染,使用商业化的ELISA试剂盒进一步确认该样品被ReMV侵染过。进一步克隆ReMV河南分离物的MP序列,并结合NCBI数据库中发布的该病毒MP序列,构建了基于MP序列的ReMV河南分离物系统发育树。该研究丰富了ReMV群体的传播范围及其基因组遗传信息,为后续ReMV的深入研究奠定了基础。; 郭枭冯陈尉庄新建丁诗文董卓倬贺振张坤; 关键词：地黄基因克隆

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