巩蔚
- 作品数：12 被引量：10H指数：2
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所更多>>
- 发文基金：云南省科技厅科研基金国家科技重大专项国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究被引量：2
- 2014年
- 目的:重组新蛭素(EH)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(EPR)的衍生物,以往EH的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低。而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化。为了提高EH的生产效率,探索了EH在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:首先通过PCR的方法获得eh的c DNA,PCR产物连接入原核表达载体p ET-22或p ET-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(ply Ss),获得重组工程菌BL21(DE3)-p ET-24-eh,BL21(DE3)-p ET-22-eh,BL21(ply Ss)-p ET-22-eh。重组工程菌进行IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:EH在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达。表达水平较高的为BL21(DE3)-p ET-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,IPTG浓度为0.4μmol/L,诱导前菌种密度在OD600=1左右。诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93%。最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的EH蛋白本身无抗凝活性,被FXa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性。结论:实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高EH的生产效率,为EH的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径。
- 张超巩蔚郭莹莹孙卫国姚敏于爱平
- 关键词：原核表达可溶性表达抗凝
- 抗树鼩CD3分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用
- 本发明涉及一种抗树鼩CD3分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，属于分子生物学技术领域。该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TSCD3‑77B2，保藏号为CCTCC NO:C2...
- 徐靖雯董少忠张雪梅吴忠香蒋曦朱文兵宋杰李慧巩蔚严丽蔚
- 文献传递
- 抗树鼩CD3ε单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定被引量：1
- 2018年
- 目的：制备鼠抗树鼩CD3ε单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：以GST-CD3ε蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术融合免疫后的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,通过间接酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测,筛选出多株能分泌抗树鼩CD3ε的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆筛选后,制备小鼠腹水单克隆抗体,并纯化得到鼠抗树鼩CD3ε单克隆抗体,通过腹水单克隆抗体效价测定、单克隆抗体亲和力测定、单克隆抗体抗原表位分析、Western blot和流式细胞荧光分选技术（fluorescence activated cell sorting,FACS）分析其生物学特性。结果：筛选到5株能稳定分泌抗树鼩CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为78I、87I、92D1、75II和35C8,腹水单克隆抗体效价分别为1∶10～6、1∶10～6、1∶10～4、1∶10～6、1∶10～3,亲和力解离常数（Kd）分别为1.8×10^-5、2.9×10^-5、4.9×10^-5、7.3×10^-5、3.6×10^-5。5株单克隆抗体抗原表位分析显示78I、87I和75II识别同一抗原表位,而92D1和35C8识别另一抗原表位。经Western blot检测,HRP标记后的92D1能识别GST-CD3ε蛋白和树鼩外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,并对大鼠、小鼠和猴的PBMC有抗体交叉反应。经FACS检测,PE-Cy5.5标记后的92D1能特异性识别树鼩PBMC。结论：成功制备出鼠抗树鼩CD3ε的单克隆抗体,为进一步应用于树鼩免疫检测奠定基础。
- 徐婧雯张雪梅吴忠香朱文兵蒋曦巩蔚严丽蔚宋杰李慧董少忠
- 关键词：树鼩单克隆抗体
- 狂犬病病毒糖蛋白表达及纯化及其记忆性B细胞结合能力的分析被引量：3
- 2017年
- 表达纯化不同标签、不同大小3个狂犬病病毒糖蛋白,分析其结合功能后,得到具备高亲和力的、可特异性结合记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。本实验通过基因工程的方法,采用不同的原核表达系统分别表达带有不同标签的、全长和膜外区的RVG,纯化蛋白并分析比较其结合功能,荧光标记候选蛋白,结合CD19及CD27的抗体,流式细胞术检测狂犬疫苗免疫后PBMCs中抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞的情况,确认候选蛋白与抗狂犬病毒特异性记忆性B细胞的结合功能。本实验成功构建了3个表达载体pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G,优化表达纯化条件成功获得了糖蛋白GST-RVG、His-RVG和His-G。纯化后的GST-RVG、His-RVG和His-G经Western blotting和ELISA鉴定均有抗原特异性;由竞争ELISA法测得3个纯化后糖蛋白与抗狂犬病病毒抗体的亲和力。通过流式细胞术可以检测到狂犬疫苗免疫后阳性志愿者PBMCs中的抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞,从而获得了高亲和力、可用于分选抗原特异性的记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。
- 严丽蔚巩蔚朱文兵张雪梅徐婧雯吴忠香卢孔杰孙明董少忠
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白流式细胞术
- 抗树鼩CD4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用
- 本发明涉及一种抗树鼩CD4分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，属于分子生物学技术领域。该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS‑CD4‑38，保藏号为CCTCC NO:C20...
- 董少忠张雪梅徐靖雯吴忠香卢孔杰代解杰孙晓梅宋杰李慧巩蔚严丽蔚朱文兵
- 树鼩CD4蛋白多克隆抗体的制备及检测被引量：1
- 2016年
- 目的 原核表达、纯化树鼩CD4蛋白并制备多克隆抗体,检测树鼩体内的CD4蛋白.方法 克隆树鼩CD4基因并连接到表达载体,构建重组质粒pET30a（＋）-CD4和pGEX-5X-1-CD4,表达并纯化重组蛋白His-CD4和GST-CD4,用不同佐剂[弗氏佐剂、MF59和A1（OH）3]制备多抗,用Western blot法检测血清抗体特异性.结果 蛋白表达产物His-CD4和GST-CD4的相对分子质量分别约为53.5×103和70.0×103,纯化后蛋白浓度分别为600 μg/mL和1 mg/mL;三组佐剂均能诱导产生抗体,抗体几何平均滴度（Geometric Mean Titer,GMT）的比较结果为：弗氏佐剂组（GMT：97 420）＞Al（OH）3佐剂组（GMT：67 202）＞MF59佐剂组（GMT：55 128）;其中弗氏佐剂组显著高于原蛋白组（P＜0.001）;Al（OH）3组显著高于原蛋白组（P＜0.01）;而MF59组显著高于原蛋白组（P＜0.05）.结论 制备了特异性良好的小鼠抗血清,能够特异性地结合树鼩的CD4蛋白.为下一步本实验室制备CD4单克隆抗体、CD4蛋白分子的功能研究以及树鼩的病毒感染模型等免疫相关实验的进行提供了基础.
- 卢孔杰徐婧雯张雪梅吴忠香任芳芳马娜巩蔚严丽蔚朱文兵董少忠
- 关键词：树鼩纯化多克隆抗体
- 抗树鼩干扰素γ单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用
- 本发明涉及一种抗树鼩干扰素γ单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，属于分子生物学技术领域。该杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS‑IFNγ‑13，保藏号为CCTCC...
- 董少忠张雪梅徐靖雯吴忠香卢孔杰代解杰孙晓梅宋杰李慧巩蔚严丽蔚朱文兵
- 文献传递
- 狂犬病病毒CTN-1株G蛋白的原核表达及基本功能评价被引量：2
- 2016年
- 目的原核表达狂犬病病毒(rabies virus,RV)CTN-1株G蛋白,并评价其基本功能。方法采用RT-PCR法扩增RV CTN-1株G蛋白基因,插入原核表达载体p GEX-5X-1,构建重组表达质粒p GEX-5X-1-CTN,转化入Rosetta(DE3)p Lys S,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析纯化后,采用间接ELISA法检测其与阳性血清的结合性能及亲和力。结果重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;纯化的重组蛋白RV-G相对分子质量约85 000,纯度可达85%,能与阳性血清特异性结合,且具有较好的区分性,与阳性血清的亲和力常数为1.2×1010 M-1。结论成功原核表达、纯化获得了纯度较高、特异性较好、亲和力较强、灵敏度较高的RV CTN-1株G蛋白,为研究G蛋白的抗原表位、建立针对RV G蛋白的ELISA抗体检测方法及其中和抗体的分选检测奠定了基础。
- 巩蔚严丽蔚朱文兵张雪梅徐婧雯吴忠香卢孔杰孙明董少忠
- 关键词：狂犬病病毒G蛋白原核细胞酶联免疫吸附测定
- 抗树鼩CD3分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用
- 本发明涉及一种抗树鼩CD3分子单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用，属于分子生物学技术领域。该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏名称为杂交瘤细胞株TS‑CD3‑77B2，保藏号为CCTCC NO:C...
- 徐靖雯董少忠张雪梅吴忠香蒋曦朱文兵宋杰李慧巩蔚严丽蔚
- 肠道病毒71型鼠源性中和单克隆抗体的制备被引量：1
- 2018年
- 目的制备肠道病毒71型(enterovirus A 71,EV71)鼠源性中和单克隆抗体。方法以灭活EV71病毒液为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得抗EV71单克隆抗体;ELISA法检测抗体的特征,获得具有高效结合性的单克隆抗体;SDS-PAGE和Western blot法鉴定Protein A纯化的抗体;通过体外和体内中和试验鉴定抗体的中和特性。结果得到3株针对EV71 VP1的高效结合性单克隆抗体15H7、15G7和6G2,且15H7经中和试验证明具有较强的中和活性。结论成功制备了EV71鼠源性中和单克隆抗体,其在小鼠体内能成功地抑制病毒增殖。
- 朱文兵严丽蔚巩蔚张雪梅吴忠香徐婧雯宋杰董少忠
- 关键词：肠道病毒71型单克隆抗体
