龙海亭
- 作品数：17 被引量：21H指数：3
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所更多>>
- 发文基金：云南省自然科学基金云南省社会发展科技计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学化学工程农业科学更多>>
- 一种检测血清中抗EV‑D68病毒抗体的方法
- 本发明公开了一种检测血清中抗EV‑D68病毒抗体的方法。提取EV‑D68病毒基因组RNA，通过反转录和PCR扩增反应得到VP1基因的cDNA，将其克隆到克隆载体，再将转入表达载体得到重组表达质粒，转化宿主菌并用IPTG诱...
- 刘龙丁郑惠文孙明王晶晶郭磊李冰香龙海亭李洪哲范海涛杨泽宁储曼曼黄星
- 文献传递
- 重组人甲状旁腺激素肽(1-34)在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化被引量：3
- 2006年
- 人工合成人甲状旁腺激素1～34肽段(PTH134)的cDNA序列,克隆到大肠杆菌蛋白表达载体pThioHis中,获得了高表达菌株。经发酵、破菌、金属螯合层析、反相层析和凝胶层析后获得了纯度大于95%的hPTH134,hPTH134肽N端测序和质谱分子量测定结果与天然PTH134一致。生物学活性研究表明,hPTH134在体外具有刺激腺苷酸环化酶的作用。
- 李健峰肖红剑姬秋彦李智华龙海亭阎玲梅罗娜徐维明
- 关键词：人甲状旁腺激素大肠杆菌
- 一种新型广谱流感病毒亚单位疫苗的表达与纯化被引量：2
- 2007年
- 通过引物设计,利用重叠延伸PCR(OE-PCR)和搭桥PCR方法扩增得到A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜区基因以及HA多表位基因,分别克隆测序后以pET28a+为表达载体构建重组质粒pET28a+-M2d-HA。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得了高效表达流感病毒缺失跨膜区M2蛋白和HA多表位蛋白片段重组融合蛋白的工程菌,表达的重组蛋白约占菌体总蛋白的45%左右。表达的蛋白以包涵体形式存在,包涵体经亲和层析和阴离子交换层析纯化后复性,得到纯度在90%以上的目的蛋白。Westernblot结果显示纯化的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。为进一步研究广谱型流感病毒亚单位疫苗奠定了基础。
- 魏义举龙海亭杨旭李建芳毕研伟李健峰徐维明
- 关键词：流感病毒亚单位疫苗多表位表达纯化抗原性
- 肠道病毒EV-D68表面结构蛋白VP2、VP3的原核表达及其特异性分析
- 2018年
- 目的原核表达肠道病毒68型(enterovirus D68,EV—D68)表面结构蛋白VP2、VP3,分析其亲和力和结合力,得到具备高结合力的、可结合特异性记忆性B细胞的EV-D68病毒表面结构蛋白。方法采用PCR法扩增EV-D68病毒的VP2、VP3蛋白基因,插入原核表达载体pGEX-5X-1,构建重组表达质粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,转化到工程菌Rosetta(DE3)pLy中,异丙基硫代半乳糖苷(i-sopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,表达的重组蛋白形成包涵体,经超声洗涤、透析复性;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel immunosorbent,SDS-PAGE)电泳、westem-blot鉴定重组蛋白;竞争性酶联免疫吸附检测(eIlzyme linked immunosorbent assay,EusA)检测蛋白VP2、VP3的蛋白活性和亲和力;藻红蛋白荧光素(phycoeryth面,PE)标记VP2和VP3重组蛋白,结合CD19-APC、CD27-nTc抗体,流式细胞术检测VP2、VP3蛋白结合特异性记忆性B细胞的情况。结果成功构建出重组表达质粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,通过双酶切鉴定及测序分析,确认表达载体构建正确,通过表达纯化,成功获得EV-D68的VP2、VP3蛋白,SDS-PAGE电泳灰度扫描显示,VP2蛋白的纯度可达80%,VP3蛋白的纯度可达75%;经westem-blot和EusA鉴定,均有抗原特异性;通过竞争EusA检测,VP2亲和力常数为2.7×10^7M^-1,为中等亲和力;VP3亲和力常数为3.25×10^6M^-1,为低亲和力;通过流式细胞术可以检测到病毒攻击小鼠后脾脏细胞中的特异性记忆性B细胞。结论成功原核表达,复性纯化得到EV-D68VP2、EV-D68VP3蛋白,两个蛋白均具有较强的抗原特异性,利用流式细胞仪能检测到特异性记忆性B细胞。最终获得了具有较强结合能力,可用于分选抗原特异性记忆性B细胞的EV-D68表面结构蛋白VP2、VP3,为研究VP2、VP3蛋白的中和抗原表位及其广谱中和抗体的分选检测打下了基础。
- 龙海亭孔璟郑惠文李冰香张寒李恒刘玉斌范海涛于丽廖国阳孙明刘龙丁
- 关键词：VP2蛋白VP3蛋白原核表达
- 慢病毒介导的HIF-1α mODD在肿瘤细胞中的高表达
- 2011年
- 目的在肿瘤细胞中利用重组慢病毒介导缺氧诱导因子-1α突变体(HIF-1α mODD)在正常氧压下高表达,以模拟肿瘤缺氧微环境下肿瘤细胞中HIF-1α的高表达,为研究HIF-1介导的缺氧信号通路及其在肿瘤细胞中的作用提供实验模型。方法将含HIF-1αmODD基因片段的慢病毒表达质粒pWPI GW/HIF-1α mODD,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装制备重组慢病毒,重组病毒经过纯化后直接感染GLC、H157和YTMLC等肿瘤细胞,并在正常氧压条件下培养,通过RT-PCR、免疫印迹等方法检测HIF-1α mODD在细胞中的表达水平。结果重组慢病毒介导HIF-1α mODD在GLC、H157和YTMLC细胞内获得高表达。结论成功模拟了肿瘤细胞在缺氧微环境下高表达HIF-1α的情况,为体外研究HIF-1α在肿瘤血管新生及肿瘤生长中的作用提供途径。
- 赵玉娇龙海亭潘玥李华陈俊英施海晶马绍辉孙强明
- 关键词：HIF-1Α慢病毒缺氧微环境
- Ⅳ型登革病毒中国株LD34在KMB17细胞上的适应性及其生物学特性被引量：1
- 2012年
- 目的研究Ⅳ型登革病毒中国株LD34在人胚肺二倍体细胞KMB17上的传代适应性及其生物学特性。方法将Ⅳ型登革病毒中国株LD34在C6/36细胞上扩增,并采用微量细胞病变法测定病毒的感染性滴度。以2.0 MOI的病毒接种KMB17细胞传代培养,筛选KMB17细胞适应株,并进行培养条件的优化。将Ⅳ型登革病毒中国株LD34 KMB17细胞适应株连续传10代,测定病毒的感染性滴度,免疫荧光法检测病毒的抗原性,RT-PCR法扩增登革病毒的特异性基因。结果筛选出的Ⅳ型登革病毒中国株LD34在KMB17细胞上的最佳培养条件为病毒接种MOI 0.4,培养基血清浓度5%;其感染KMB17细胞后可产生明显的细胞病变(CPE),连续传10代,病毒滴度达7.75 CCID50/ml;第10代病毒的抗原性呈阳性;第10代病毒能扩增出511 bp的登革病毒特异性基因和393 bp的Ⅳ型登革病毒特异性基因。结论获得了Ⅳ型登革病毒中国株LD34 KMB17细胞适应株,病毒保持了原始毒株的基本生物学特性,且具有较好的抗原性。
- 赵玉娇龙海亭潘玥陈俊英杨丽娟岳耀斐孙强明
- 关键词：登革病毒人胚肺二倍体细胞适应性生物学特性
- sTRAIL基因的表达、纯化及其生物学活性的初步研究
- 2003年
- 在原核表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (sTRAIL)分子 ,纯化表达产物 ,并进行初步的生物学活性的研究中 ,通过提取外周血淋巴细胞总RNA进行RT PCR克隆sTRAILcDNA ,构建sTRAIL的原核表达载体 ,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定 ,IPTG诱导表达。以发酵罐放大培养 ,SDS PAGE和Western blot确认表达 ,用亲和层析和阳离子层析纯化表达产物 ,使用L92 9、Qay肝癌、K5 6 2人白血病等肿瘤细胞鉴定活性。结果发现重组表达的sTRAIL融合蛋白占总蛋白的 39% ,单纯蛋白纯化后纯度达 95 % ,用抗人TRAIL多抗可以确认表达了TRAIL分子 ,能诱导几株肿瘤细胞凋亡。原核表达系统正确表达了TRAIL分子 ,并摸索了中试生产的条件 。
- 杨芳徐维明刘红岩龙海亭肖红剑李燕
- 关键词：TRAIL原核表达纯化生物学活性
- 兽医在高等级生物安全动物实验室活动中的作用
- 2023年
- 随着急性呼吸道综合症、中东呼吸综合征、西尼罗病毒、埃博拉病毒、猴痘、禽流感、新冠病毒肺炎等疾病从地域性流行演变为全球范围内暴发和流行,形成了传染性极强及危害性极大的烈性传染病。高等级生物安全动物实验室成了开展高危险度烈性病原体研究必需的技术平台,其中兽医在高等级生物安全动物实验室活动及生物安全评价与管理工作中的角色和作用日益重要。本文结合高等级生物安全动物实验室的工作内容、实验活动风险及责任目标,从动物实验设计、动物实验操作技术推广与运用、实验动物福利伦理监督与管理、生物安全控制、人畜共患病防控等方面,阐述了新形势下兽医在高等级生物安全动物实验室中的作用。
- 高家红龙海亭董荫良匡德宣
- 关键词：兽医动物实验生物安全
- 我国兽医立法及技术支撑体系的探讨
- 2023年
- 经济和社会发展以及公共卫生事件的发生共同催生了兽医体制改革,国家不断加强各级兽医行政管理、立法监督、技术支撑机构建设,我国兽医事业立法及技术支撑体系的整体水平得以显著提高。本文对我国兽医法律、法规、技术支撑体系改革等方面进行梳理分析,以期这些政策法规为今后我国兽医事业的建设发展起到借鉴作用。
- 龙海亭高家红董荫良匡德宣
- 关键词：兽医法律法规技术支撑体系
- 单纯疱疹病毒I型糖蛋白D在酵母中的表达被引量：2
- 2006年
- 从提取的HSV-1基因组中扩增得到编码gD蛋白胞外区1～314aa的基因gDt,将其插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建携带gDt的重组载体,经电转化GS115菌株和G418筛选,得到了高效分泌表达gD蛋白的毕赤酵母菌株,表达量达到250mg/L,该目的蛋白可被gD单抗(1-I-9)特异性识别。表达产物经离子交换、金属螯合、分子筛柱层析纯化后得到纯度较高的重组蛋白。重组gD蛋白免疫BALB/c小鼠可诱生一定水平的特异性抗体,表明该蛋白具有较好的免疫原性,能够诱导小鼠产生体液免疫应答。
- 李智华徐维明姬秋彦龙海亭彭正华李健峰
- 关键词：单纯疱疹病毒毕赤酵母表达纯化
