方立
- 作品数：15 被引量：53H指数：5
- 供职机构：中南大学湘雅医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金长沙市科技局科技项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖与表型转化的抑制作用及其机制研究
- 第一章内皮祖细胞与血管平滑肌细胞共培养条件下内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响
研究背景：近年来大量研究提示内皮祖细胞/(endothelial progenitor cell, EPCs/)能够延缓高血压、...
- 方立
- 关键词：增殖增殖表型转化增殖表型转化
- 文献传递
- 胶质细胞源性神经营养因子基因修饰CD34^+细胞静脉移植治疗高血压大鼠脑梗死
- 2010年
- 背景:近年来,已有实验证实经颅直接给予胶质细胞源性神经营养因子(glialcell-derived neurotrophic factor,GDNF)或携带GDNF基因病毒载体有显著减少脑梗死体积、促进神经功能恢复的疗效,但其治疗方法有创,临床应用有限。目的:观察GDNF基因转染的人脐血CD34+细胞经静脉移植对自发性高血压大鼠脑梗死的疗效,并探讨其机制。方法:分离人脐血CD34+细胞,脂质体方法转染pEGFP-GDNF质粒和pEGFP空载体至CD34+细胞制备pEGFP-GDNF-CD34+和pEGFP-CD34+细胞;制备60只雄性自发性高血压大鼠大脑中动脉栓死模型并随机分为3组:pEGFP-GDNF-CD34+细胞移植组(基因细胞组)、pEGFP-CD34+细胞移植组(单纯细胞组)、生理盐水组。改良神经功能损害评分评价神经功能恢复状况;图像分析法观察TTC染色脑梗死体积;酶联免疫法检测细胞培养液与脑组织匀浆GDNF水平,荧光显微镜及免疫组织化学检测绿色荧光蛋白标记CD34+细胞及其人神经胶质纤维酸性蛋白和人神经元核抗原表达。结果与结论:经静脉移植pEGFP-GDNF-CD34+细胞向自发性高血压大鼠脑缺血区域迁移、存活、并向神经细胞定向分化,促进神经功能恢复。GDNF基因转染CD34+细胞在脑组织存活、向神经细胞分化及对大脑神经功能保护作用优于CD34+细胞。脑组织GDNF水平可能是GDNF基因转染CD34+细胞和单纯CD34+细胞移植治疗自发性高血压大鼠局灶性脑缺血疗效差异机制之一。
- 欧雅莉余国龙杨天伦方立胡柯
- 关键词：胶质细胞源性神经营养因子CD34+细胞高血压大鼠
- 降钙素基因相关肽介导内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化被引量：5
- 2010年
- 目的初步探讨内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的分子机制。方法从人脐带血分离、培养、诱导内皮祖细胞分化并鉴定,制备早期内皮祖细胞条件培养基,酶联免疫吸附试验检测降钙素基因相关肽分泌情况。经降钙素基因相关肽抗体预处理内皮祖细胞条件培养基或阻断内皮祖细胞降钙素基因相关肽受体后,采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹观察内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞收缩表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白以及合成表型标志基因骨桥蛋白表达变化的作用;进一步观察内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖信号通路(ERK、核因子κB通路)的作用。结果早期内皮祖细胞能够分泌较高浓度的降钙素基因相关肽,并且较晚期内皮祖细胞及脐静脉内皮祖细胞高;内皮祖细胞条件培养基处理能明显抑制血管平滑肌细胞表型转化;阻断降钙素基因相关肽作用后,内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的抑制能力明显降低;同时内皮祖细胞条件培养基能够明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的ERK以及核因子κB通路的活化;阻断降钙素基因相关肽作用后,内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的ERK、核因子κB信号通路活化的抑制能力明显降低。结论降钙素基因相关肽参与介导内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞的表型转化,其机制可能与其抑制血管平滑肌细胞ERK、核因子κB信号通路活化有关。
- 方立陈晓彬陈美芳肖智林欧亚莉谢秀梅
- 关键词：内皮祖细胞血管平滑肌细胞表型转化降钙素基因相关肽
- 内皮祖细胞对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的影响被引量：13
- 2009年
- 目的观察内皮祖细胞对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的影响。方法采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁向内皮祖细胞分化。采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定内皮祖细胞,间接免疫荧光检测血管平滑肌细胞标志物平滑肌α-肌动蛋白、钙调节蛋白的表达,采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹检测早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞收缩表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白以及合成表型标志基因骨桥蛋白表达变化的影响。结果与对照组比较,血管紧张素Ⅱ(10^(-6) mmol/L)诱导血管平滑肌细胞增殖48 h后,平滑肌α-肌动蛋白mRNA和蛋白表达明显减少,而骨桥蛋白mRNA和蛋白表达明显增加,提示血管平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化;与血管紧张素Ⅱ组比较,早期内皮祖细胞条件培养液、晚期内皮祖细胞条件培养液以及人脐静脉内皮细胞条件培养液处理后均不同程度抑制血管紧张素Ⅱ诱导的平滑肌α-肌动蛋白表达减少和骨桥蛋白表达增加,其中以早期内皮祖细胞条件培养液的抑制效果最明显。结论内皮祖细胞能够抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转化。
- 方立陈美芳余国龙肖智林谢秀梅
- 关键词：内皮祖细胞表型转化Α-肌动蛋白骨桥蛋白
- 冠状动脉粥样硬化患者血浆瘦素与脂联素关系分析被引量：4
- 2008年
- 【目的】探讨冠状动脉粥样硬化患者血浆瘦素水平与脂联素水平之间的关系。【方法】拟诊冠心病的93例患者,根据冠脉造影的结果分为对照组(NC组)20例与冠状动脉粥样硬化组(CA组)73例,计算各患者的Gensini积分,测定血浆瘦素、脂联素的浓度,以浓度的对数值分别作为瘦素、脂联素的水平并分析瘦素与脂联素之间的关系。【结果】①CA组患者血浆中脂联素水平(1.23±0.20)mg/L显著低于NC组(1.45±0.13)mg/L(P<0.01);瘦素水平(0.72±0.18)μg/L显著高于对照组(0.52±0.12)μg/L(P<0.01)。②CA组患者血浆瘦素水平与脂联素水平显著负相关(r=-0.637,P<0.01)。③CA组患者随着Gensini积分增高血浆瘦素水平逐渐增高而脂联素水平逐渐下降(P<0.01)。【结论】CA组患者冠脉狭窄程度和(或)不同节段冠脉病变程度均影响瘦素和脂联素水平,瘦素浓度越高,脂联素浓度越低。
- 吕青山谢秀梅方立范良军梁传亮
- 生长素对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响及机制被引量：1
- 2010年
- 目的观察生长素对血管紧张素Ⅱ所致的脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响。方法采取不同浓度的血管紧张素Ⅱ（10-9~10-6mol/L）刺激脐静脉内皮细胞24 h,获取最佳浓度（10-6mol/L）后用此浓度的血管紧张素Ⅱ分别刺激脐静脉内皮细胞0、6、12和24 h,观察脐静脉内皮细胞的增殖和迁移;并观察生长素（10-9~10-6mol/L）预处理2 h后与10-6mol/L血管紧张素Ⅱ共同孵育24 h和10-6mol/L生长素预处理0、0.5、1和2 h后与10-6mol/L血管紧张素Ⅱ共同孵育24 h对脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响。加入丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路阻滞剂PD98059（25μmol/L）、生长激素促分泌素受体1 a阻断剂（[Dys3]GHRP-6 25μmol/L）预处理人脐静脉内皮细胞,观察其对生长素影响血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞增殖和迁移的作用。水溶性四氮唑8法测细胞增殖,Transwell小室测细胞迁移,免疫印迹法测细胞中细胞外信号调节激酶1/2、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达。结果血管紧张素Ⅱ呈浓度和时间依赖性促进内皮细胞迁移和增殖。生长素抑制血管紧张素Ⅱ引起的内皮细胞迁移和增殖呈浓度和时间依赖性。PD98059（25μmol/L）预处理可以抑制血管紧张素Ⅱ促内皮细胞增殖作用,[Dys3]GHRP-6（25μmol/L）预处理阻断生长素对内皮细胞迁移和增殖的抑制作用。生长素可减少磷酸化细胞外信号调节激酶1/2的表达。结论生长素可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的内皮细胞增殖和迁移,其机制涉及细胞外信号调节激酶1/2途径。
- 邓彬陈美芳陈晓彬方立谢秀梅
- 关键词：生长素人脐静脉内皮细胞细胞增殖细胞迁移信号通路
- 细胞膜表面核仁素的功能被引量：4
- 2007年
- 核仁素(又称C23)是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质,具有多种生物学功能,包括调控核糖体的生物合成与成熟、参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制、核仁的发生以及抗细胞凋亡作用。核仁素可作为多功能穿梭蛋白穿梭于细胞浆和细胞核之间,甚至表达在细胞膜上,如肿瘤细胞、免疫细胞以及血管内皮细胞等,这种细胞膜表面核仁素可充当多种蛋白分子、细菌、病毒的受体或共受体,并介导这些配体的生物学效应及病原微生物对宿主细胞的入侵。
- 方立王慷慨肖献忠
- 关键词：细胞膜
- 核仁素在不同细胞膜表面的表达被引量：5
- 2007年
- 目的探讨核仁素(又称C23)蛋白在不同细胞膜表面的表达。方法采用活细胞间接免疫荧光、活细胞流式细胞术以及细胞膜蛋白分离结合免疫印迹等方法检测核仁素蛋白在大鼠H9C2胚胎心肌细胞、小鼠C2C12肌原细胞、小鼠RAW264.7巨噬细胞、人HeLa宫颈癌细胞及人THP-1单核细胞等细胞膜表面的表达。结果间接免疫荧光检测发现核仁素在上述细胞膜上呈散点状分布,与已知的细胞膜蛋白Fas的分布一致;流式细胞术表明核仁素抗体检测使各种细胞发出的荧光量明显高于正常IgG检测时所发出的荧光量,其中THP1细胞中各种荧光量均值分别为:核仁素抗体16.74,Fas抗体11.14,IgG为8.58;HeLa细胞中荧光量均值为:核仁素抗体16.84,Fas抗体10.39,IgG为9.01;通过提取上述五种细胞的膜蛋白,采用免疫印迹检测发现核仁素和Fas均出现在细胞膜蛋白组分中。结论核仁素可在多种细胞膜表面表达,提示这种膜定位核仁素可能作为某些配体的受体介导信号转导,参与细胞功能的调节,为进一步深入研究核仁素的功能提供了新的思路。
- 王慷慨方立蒋碧梅邓恭华涂自智陈广文肖献忠
- 关键词：病理学与病理生理学核仁素蛋白表达RAW264.7巨噬细胞
- GDNF基因真核表达载体的构建及其在脐血CD34^+干细胞的表达被引量：3
- 2008年
- 目的构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的新型真核表达载体,为进行GDNF基因修饰的脐血干细胞移植治疗脑梗死奠定基础。方法将GDNF基因克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有GDNF基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染人脐血CD34+细胞,荧光显微镜、ELISA检测转基因脐血干细胞GDNF的表达与释放。结果经双酶切鉴定和测序证实已将GDNF基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在脐血CD34+干细胞中表达、分泌有活性的GDNF。结论成功构建pEGFP/GDNF基因新型真核表达载体。
- 欧雅莉杨天伦方立余国龙
- 关键词：基因重组真核表达载体
- 甘露醇促进人脐血CD34^+细胞通过血脑屏障静脉迁移至高血压脑梗死大鼠脑组织被引量：2
- 2011年
- 背景:单纯脐血细胞经静脉移植治疗脑梗死疗效有限,移植细胞经血脑屏障迁入脑内数量不足为重要原因之一。目的:观察血脑屏障开放剂甘露醇对人脐血CD34+细胞经静脉移植治疗高血压大鼠脑梗死疗效的影响。方法:分离人脐血CD34+细胞,脂质体方法转染pEGFPF质粒,制备pEGFP-CD34+细胞;45只雄性SD大鼠经线栓法建立大脑中动脉栓塞模型,造模后24h随机分为3组:实验组注射1×106GFP-CD34+细胞,继之注射20%甘露醇2g/kg;阳性对照组注射1×106GFP-CD34+细胞;空白对照组注射等量生理盐水。结果与结论:①荧光显微镜下实验组每张切片脑组织GFP标记阳性的绿色荧光细胞计数平均值显著多于阳性对照组。②移植后第7天治疗组与其他各组神经功能损害评分差异无显著性意义;移植后28d,各组神经功能均有不同程度恢复,实验组神经功能恢复明显优于阳性对照组和空白对照组(P<0.05)。③实验组与其他两组相比,大鼠脑梗死体积均显著减少。④实验组脑组织匀浆胶质细胞源性神经营养因子水平较阳性对照组、空白对照组明显增高。提示血脑屏障开放剂甘露醇促进静脉移植CD34+细胞通过血脑屏障迁入至脑组织,并增强静脉移植CD34+细胞治疗脑梗死的疗效。
- 余国龙欧雅莉杨天伦方立胡柯
- 关键词：CD34+细胞细胞移植静脉途径脑梗死
