【目的】构建PCGF1(Polycomb Group Ring Finger 1)基因敲除的MCF-7稳定细胞系。【方法】以PCGF1序列为模板,设计sgRNA干扰序列,两端加入载体连接序列。通过DNA片段合成所需sgRNA序列。退火形成oligo二聚体序列后,使用T4 DNA连接酶重组干扰序列与pCAG-T7-Cas9-pgk-Puro-T2A-GFP质粒。测序鉴定后,将pCAG-T7-Cas9-gRNA-pgk-Puro-T2AGFP重组载体通过脂质体转染MCF7细胞系。通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选,Western blotting检测PCGF1表达。【结果】测序结果显示构建的重组载体序列正确。转染筛选后,western blotting验证构建的MCF7细胞系PCGF1表达明显降低。【结论】利用pCAG-T7-Cas9-pgk-Puro-T2A-GFP质粒,成功构建PCGF1敲低载体。转染MCF7细胞系,通过嘌呤霉素筛选和western blotting验证得到PCGF1稳定敲低的MCF7细胞系。
