周茂彬
- 作品数：3 被引量：0H指数：0
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- 小鼠P2X_7受体基因短发夹RNA慢病毒载体构建与鉴定
- 2017年
- 目的应用RNA干扰技术构建小鼠P2X_7受体(P2X_7R)基因重组慢病毒载体并鉴定。方法对小鼠P2X_7R mRNA分析,设计合成单链引物,经退火后形成双链寡核苷酸序列,放入经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,连接构建慢病毒干扰载体pLVX-shRNA-P2X_7R。筛选出阳性克隆,进行基因测序鉴定。测序验证正确后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清。经浓缩后感染小鼠RAW264.7细胞,采用流式细胞术评价病毒滴度及感染效率;利用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法鉴定P2X_7R shRNA慢病毒的干扰效率。结果测序证实,成功地构建了重组质粒pLVX-shRNA-P2X_7R及小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。重组慢病毒的滴度为2×1010TU·L^(-1),感染效率约为95%。干扰效率约为70%。结论应用RNA干扰技术可成功构建小鼠P2X_7R基因shRNA慢病毒载体。
- 焉力方李鑫姬文婕周茂彬李琦李玉明周欣
- 关键词：慢病毒载体RAW264.7细胞
- 血红素氧化酶-1基因过表达对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响
- 2017年
- 【目的】建立血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)稳定过表达细胞株RAW264.7,探讨HO-1过表达对其增殖活性和细胞凋亡的作用。【方法】用携带小鼠HO-1基因的重组慢病毒感染小鼠RAW264.7细胞,经嘌呤霉素筛选获得HO-1稳定过表达细胞株。细胞分为野生型组(WT)、阴性对照组(NC)和过表达组(Lenti-HO-1)。用Real-Time PCR检测细胞中HO-1mRNA的表达。用Western blotting检测细胞中HO-1蛋白的表达。用CCK-8法检测细胞的增殖活性。用流式细胞术检测细胞的凋亡水平。【结果】HO-1慢病毒能促进RAW264.7细胞HO-1 mRNA和蛋白的稳定过表达。Lenti-HO-1组细胞的增殖活性显著低于WT组和NC组(P<0.05)。Lenti-HO-1组凋亡细胞的比例显著高于NC组(P<0.05)。【结论】本研究成功构建了HO-1稳定过表达的RAW264.7细胞株,HO-1过表达能够降低RAW264.7细胞的增殖活性,增加凋亡细胞的比例,其为进一步探讨HO-1在巨噬细胞所参与病理生理机制中的作用奠定了基础。
- 周茂彬李鑫李琦姬文婕焉力方闫睿周欣李玉明
- 关键词：血红素氧化酶-1RAW264.7巨噬细胞细胞增殖慢病毒
- 小鼠盐皮质激素受体基因shRNA慢病毒干扰系统的建立与鉴定
- 2017年
- 【目的】应用RNA干扰技术,构建小鼠盐皮质激素受体(mineralcorticoid receptor,MR)基因重组慢病毒载体并鉴定。【方法】根据本室已经筛选的有效RNA干扰序列和阴性对照序列,合成单链引物并经退火形成双链寡核苷酸序列,连接经EcoR I和BamH I双酶切线性化的pLVX-shRNA-Puro慢病毒质粒载体中,提取质粒DNA并经测序验证。测序正确后,在Lipofectamine~3000的介导下,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞,收集病毒上清经浓缩后感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,流式细胞术评价其滴度及感染复数,实时定量PCR法鉴定MR shRNA慢病毒的干扰效率。【结果】成功构建了重组质粒pLVX-shRNA-MR,经DNA测序验证载体构建成功。流式细胞术测定重组慢病毒的感染复数大约为100,实时定量PCR法和Western Blot法检测干扰效率大约为75%左右。【结论】成功构建出小鼠MR基因shRNA慢病毒干扰系统。
- 焉力方李鑫姬文婕周茂彬李琦李玉明周欣
- 关键词：慢病毒载体RNA干扰RAW264.7细胞
