王云龙
- 作品数：86 被引量：211H指数：7
- 供职机构：郑州职业技术学院更多>>
- 发文基金：河南省科技攻关计划国家自然科学基金河南省杰出人才创新基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学轻工技术与工程更多>>
- 含分子内佐剂的SARS-CoV-2 RBD域重组蛋白制备及免疫效果评价被引量：4
- 2022年
- 制备含破伤风毒素肽(tetanus toxin,TT)、促吞噬肽(tuftsin)和新型冠状病毒刺突蛋白(spike,S蛋白)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的融合蛋白,探讨分子内佐剂对RBD蛋白体液免疫和细胞免疫效果的影响。将破伤风毒素肽、促吞噬肽与S蛋白RBD区域通过柔性多肽串联,密码子优化后构建重组载体,原核表达纯化制备重组S-TT-tuftsin蛋白,与铝佐剂混合后免疫BALB/c小鼠,对其体液及细胞免疫效果进行评价。重组S-TT-tuftsin蛋白以包涵体形式表达,离子交换层析纯化后采用梯度透析进行复性,复性蛋白经Dot blotting鉴定,可与新冠亚单位疫苗(安徽智飞公司)免疫后人血清发生反应。小鼠免疫实验结果表明,免疫35 d时抗体水平到达平台期,含分子内佐剂重组蛋白(铝佐剂)免疫小鼠后血清ELISA抗体效价高达1︰66240,显著高于S-RBD蛋白(铝佐剂)免疫小鼠抗体效价(P<0.05)。同时,含分子内佐剂重组蛋白刺激小鼠产生更强的淋巴细胞增殖能力,刺激指数可达4.71±0.15,相较于S-RBD蛋白的刺激指数1.83±0.09具有显著性差异(P<0.0001)。分子内佐剂破伤风毒素肽和促吞噬肽可显著增强新冠S蛋白RBD域的体液免疫和细胞免疫效果,可为新冠亚单位疫苗和其他病毒亚单位疫苗的研制提供理论基础和参考。
- 蒋静雯王云龙李玉林王继创张怡青王旭东王晓军张恒
- 关键词：新型冠状病毒重组蛋白免疫
- 甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立被引量：3
- 2011年
- 建立甲型H1N1流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法,通过优化IPTG浓度和诱导时间确定HA融合蛋白的最佳表达条件,并进行Western bloc和血凝试验鉴定。用纯化蛋白制备单克隆抗体,建立检测甲型H1N1流感病毒的双抗体夹心ELISA检测方法,对其交叉反应、符合率进行验证。结果表明,HA蛋白在BL21(DE3)中得到表达,主要以包涵体的形式存在,分子质量为64 ku,最佳诱导条件为IPTG终浓度0.2 mmol/L,诱导时间4 h。Western blot鉴定其与H1N1病毒有相同的抗原性,血凝试验表明无血凝活性。制备HA单抗并初步建立双抗体夹心ELISA检测方法,检测100份阳性PCR样本,符合率为96%。建立的夹心ELISA方法可用于H1N1亚型流感病毒的初步诊断。
- 王云龙周春峰孙新城李玉林陈冬焕李恒思昌静峰王国强董彩文刘旺根
- 关键词：血凝素甲型H1N1流感病毒原核表达双抗体夹心ELISA
- 人类功能已知基因RNA干扰质粒文库的构建
- 王云龙李玉林孙新城王国强王继创程蕾董彩文李恒思范玉萍邓黎黎
- RNA干扰现象是生物普遍存在的一种进化保守机制。RNA干扰技术因其具有快速、简捷、稳定等优势，在病毒防御、基因调控、功能基因组研究、疾病基因治疗、新药开发等方面广泛应用。RNAi文库因其具有高效、规模大、通量大的特点，成...
- 关键词：
- 关键词：功能基因组学
- 猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立被引量：9
- 2009年
- 通过RT-PCR方法克隆了猪瘟病毒（CSFV）5’端非编码区（UTR）的一段靶序列，构建重组质粒作为标准阳性模板。同时根据GenBank中的靶序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针。通过条件优化，以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了CSFV检测的荧光定量PCR方法。结果表明，该方法检测灵敏度可达1．0×10^0拷贝／μL，线性范围为10^9～10^0，达10个数量级；对起始浓度为1．0×10^9、1．0×10^8、1．0×10^7拷贝／μL的标准品的最终实际测得值（Ct）分别为19．73、22．95和26．24；变异系数分别为0．61％、1．77％和1．18％，均小于5％，说明此方法具有良好的准确性和重现性。对阳性组织病料的检测表明，该方法的检测灵敏度高出常规PCR，与套式PCR具有相近的灵敏度。
- 王云龙刘建营韩洁陈小科李玉林
- 关键词：猪瘟病毒荧光定量PCRTAQMAN探针
- 甲型H1N1流感病毒血凝素基因的原核表达及用于胶体金检测方法的研究
- 2011年
- 根据GenBank公布的甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因序列,合成HA全长基因,构建原核表达载体pET-30 Xa/LIC-HA。阳性质粒转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测的结果表明,HA基因获得表达,产物具有免疫学活性,分子质量约64 ku,以包涵体形式存在。以纯化的重组蛋白作为抗原初步建立了双抗原夹心检测甲型H1N1流感HA抗体的胶体金方法。该方法能检测出甲型H1N1流感阳性血清,为疫苗效果的评价奠定了基础。
- 王云龙郭文丽孙新城李玉林李恒思陈冬焕王真董彩文刘旺根
- 关键词：甲型H1N1流感病毒血凝素原核表达胶体金
- 肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段的克隆及原核表达
- 2012年
- 根据GenBank公布的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白羧基端序列(AF290001.1),设计合成2对特异性引物,采取套式PCR方法,以肺炎支原体培养物中提取的DNA为模板,扩增肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,将其克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a/P1(3 802～4 695),转化大肠埃希菌BL21-gold,测序验证后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE表明重组蛋白表观分子质量与预期一致,可溶性表达产物经Western blot证实重组蛋白具有免疫反应性。
- 王云龙刘小聪李玉林王国强孙新城董彩文程蕾王继创邓黎黎李恒思
- 关键词：肺炎支原体P1蛋白套式PCR原核表达
- JEV-DNA实时荧光定量标准品的构建被引量：5
- 2007年
- 利用TaqMan荧光定量PCR技术,建立JEV-DNA定量标准品的制备方法。通过处理JEV减毒活疫苗提取病毒RNA,进行RT-PCR扩增目的片段,与T载体连接,转化感受态细胞,T-A克隆,测序鉴定后定量。获得预期的重组质粒,建立的标准曲线有较大的线性范围。此法制备的重组质粒标准品可用于对病毒载量进行测定。
- 周净王云龙李智涛李玲玲
- 关键词：标准品实时荧光定量PCR乙型脑炎病毒
- 麻疹病毒N蛋白原核表达纯化条件的优化被引量：1
- 2013年
- 通过构建重组表达质粒,诱导表达纯化麻疹病毒N蛋白.将麻疹病毒N蛋白基因片段与载体pET-32a(+)相连接,通过PCR方法扩增获得重组质粒pET-32a(+)/N,然后将重组质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)内,并优化诱导表达时间、温度、诱导剂浓度等条件.SDS-PAGE和Western blot蛋白印迹检测表明,麻疹病毒N蛋白分子质量约为60 kD,表达产物用Ni-NTA亲和层析和DEAE纯化后,纯度达90%.
- 侯丹丹王云龙张怡青孙新城李玉林米海王继创程蕾
- 关键词：麻疹病毒核壳蛋白原核表达蛋白纯化
- 致病性结核杆菌特异性IgG抗体ELISA检测方法的初步建立被引量：3
- 2012年
- 为建立鉴别致病性结核杆菌感染和卡介苗接种产生的IgG抗体,分别用结核杆菌的混合抗原TB1、TB2和PPD包被,以结核病患者血清为阳性对照,以PPD试验阴性健康人血清作为阴性对照,建立了TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA三种检测结核杆菌抗体的方法。20份阳性标本检测结果显示,TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA的阳性检出率分别为45%、50%、95%,100份健康人血清标本检测结果显示,TB1-ELISA、TB2-ELISA、PPD-ELISA的符合率为93%、90%、68%。研究工作为研发致病性结核杆菌感染IgG抗体检测试剂奠定了一定基础。
- 王云龙周贺娟李玉林孙新城董彩文王国强刘旺根王继创李恒思程蕾白晓静
- 关键词：结核杆菌IGG抗体酶联免疫吸附试验
- N端前脑钠肽稳定保存体系的优化被引量：1
- 2015年
- 目的:探讨血清中N端前脑钠肽(NT-proBNP)的最佳保存条件,为检测试剂盒提供性能稳定的检测参考品。方法:采用ELISA定量检测不同保存液中NT-proBNP含量的变化,单因素分析基础缓冲体系、防腐剂Proclin300及抗生素等成分对NT-proBNP保存的影响,再通过正交实验进行各因素的优化组合,确定最佳的NT-proBNP保存体系。结果:单因素确定NT-proBNP保存基础缓冲体系为0.02 mol/L pH7.2的PBS缓冲液;添加防腐剂Proclin300可使NT-proBNP在37℃中的保存时间延长1 d;选择联合添加青霉素、链霉素比各自单独添加延长NT-proBNP保存时间1 d。通过正交实验确定NT-proBNP保存液成分为0.02 mol/L pH7.2的PBS基础缓冲液配制的20%的小牛血清、1/1000的Proclin300、120 U/ml青霉素与80 U/ml链霉素,以此保存液保存NT-proBNP参考品7 d后标定的定值样本结果显示:37℃中与4℃中标定值相比仅降低了1.3%。结论:优化后的NT-proBNP血清保存液能在37℃条件下保存NT-proBNP参考品7 d。
- 王翠王云龙明亮郑配国谢南昌李玉林王继创
- 关键词：血清标本稳定性
