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RNA解螺旋酶A表达系统的探究及其动力学研究: 2016年; [目的]RNA解螺旋酶A（RNA helicase A,RHA）参与许多细胞生物学过程中,并能促进艾滋病病毒1型（HIV-1）等一些病毒的复制,本试验旨在探究温度、p H值对RHA的动力学影响。[方法]利用PCR扩增全长RHA基因,构建重组载体p ET-28a-RHA和p Cold-Ⅰ-RHA,分别转化至BL21 star（DE3）和BL21、Rosetta2菌株中,加IPTG分别在28℃和15℃中诱导表达。将全长RHA基因重组到p Fast Bac Dual载体中,然后将重组穿梭载体转化到含有杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,通过转座作用,将RHA基因整合到杆状病毒基因组中。提取重组杆状病毒基因组（重组杆粒DNA）,将重组杆粒DNA转染到sf9细胞中,收集细胞,纯化蛋白,可以得到完整的RHA。建立体外解螺旋反应体系,改变温度、p H值,检测RHA活性的变化。[结果]完整RHA在BL21、Rosetta2中可微量可溶表达。sf9可以表达有活性的完整RHA。反应温度降低时,解螺旋速率变小,RHA活性降低。p H值在6.5-8.0范围内,随着p H值升高,RHA活性升高;当p H值大于8.0时,RHA活性降低。[结论]完整的RHA在BL21、Rosetta2中可微量表达;有3＇-tailed解旋极性的RHA活性受温度、p H影响较大。; 刘红蕊吴诚诚单衍可谢青云邢刚雷静施志玉孙海凤刘斐; 关键词：RNA HELICASE 大肠杆菌表达系统杆状病毒表达系统 PH

猪圆环病毒2型与猪圆环病毒相关性系统疾病的回顾及展望被引量：20: 2015年; 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)引起猪的免疫抑制,是猪圆环病毒相关性系统疾病(PCV2-systemic disease,PCV2-SD)的主要病原,给养猪业带来了巨大的经济损失。文中从PCV2的进化历程、编码蛋白、对免疫系统的影响及技术防控四方面入手,对PCV2及PCV2-SD进行了全面回顾与展望。; 顾金燕邢刚雷静刘斐周继勇; 关键词：PCV2 进化历程编码蛋白

海兰褐壳蛋鸡小黄卵泡颗粒细胞全长转录组测序分析: 2023年; 【目的】获取鸡小黄卵泡颗粒细胞(granulosa cells of small yellow follicle,SYFG)全长转录组数据,为深入挖掘鸡卵泡发育内在分子调控信息提供参考。【方法】采用PacBio高通量测序平台,对海兰褐壳蛋鸡SYFG进行测序、过滤、聚类和矫正原始数据,获取全长转录本序列。通过生物信息学软件对全长转录本数据进行功能注释、转录因子注释、编码区序列(coding sequence,CDS)预测、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)预测筛选、简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)检测及可变剪接(alternative splicing,AS)和选择性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)分析。【结果】通过测序共获得52311条海兰褐壳蛋鸡SYFG全长转录本,长度主要分布于1~3500 bp。通过与GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot和Pfam数据库比对,对转录本序列进行注释,其中GO数据库注释了26525条转录本,KEGG数据库注释了25233条转录本,COG数据库注释了31303条转录本,NR数据库注释了34284条转录本,Swiss-Prot数据库注释了30701条转录本,Pfam数据库注释了24622条转录本。此外,经鉴定或预测,还获得了559个转录因子、40944个CDS、14699个lncRNAs、7种类型的SSR、28423个AS和2747个APA事件。【结论】本研究获得了鸡SYFG全长转录组测序数据,提升了转录本的数量和长度,完善了转录本的功能注释,分析了AS和APA事件的类型,揭示了转录本的复杂性,为进一步从转录组水平解析鸡卵泡发育的分子调节机制提供数据支持。; 片慧芳杜旭彬李妍张雨辰刘斐虞德兵; 关键词：海兰褐壳蛋鸡卵泡发育

利用CRISPR/Cas9技术构建VPS34基因敲除的A549/293T细胞系被引量：1: 2018年; 该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对VPS34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western blot技术检测发现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现,存在碱基缺失, Western blot结果显示,对应的单克隆也未检测到VPS34蛋白,可见成功获得了VPS34敲除的A549/293T细胞系。由于VPS34参与自噬起始,实验结果显示, VPS34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显著被抑制,自噬底物P62大量累积。结果表明,该方法成功获得稳定敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,且细胞中的自噬被显著抑制。同时,敲除VPS34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除VPS34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系,为后续自噬功能研究提供有力工具。; 刘玉兰李娅慧张宜娜刘斐胡伯里周继勇; 关键词：基因敲除自噬

猪流行性腹泻病毒解旋酶Nsp13表达纯化及其RNA解旋活性鉴定: 2024年; 旨在可溶性表达并纯化猪流行性腹泻病毒(PEDV)解旋酶Nsp13,并验证表达纯化得到的PEDV Nsp13蛋白具有RNA解旋活性。将pET28a(+)-PEDV Nsp13重组质粒转化到大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中,利用终浓度0.5 mmol/L的IPTG在18℃条件下诱导16 h,收集诱导后的菌体,超声破碎并收集其上清液,通过镍亲和层析技术获得纯化后的PEDV Nsp13;设计RNA底物,并建立体外解旋反应体系,验证蛋白的RNA解旋活性,并在相同时间内探究不同温度条件下PEDV Nsp13蛋白对RNA的解旋情况,进一步验证其活性。结果表明,在大肠杆菌系统中可溶性表达了PEDV Nsp13蛋白,纯化后蛋白浓度可达0.9 mg/mL;通过体外解旋试验,验证了PEDV Nsp13蛋白具有ATP依赖的RNA解旋酶活性,并发现PEDV Nsp13蛋白的RNA解旋酶活性在一定范围内随解旋温度的升高而提高。本研究结果为进一步深入研究PEDV Nsp13的RNA解旋作用机制奠定了基础。; 沈熹涓姬晶晶金慧琴李宇哲刘斐单衍可; 关键词：PEDV 可溶性表达

SARS-CoV-2入胞活细胞示踪平台的建立被引量：1: 2023年; 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)由于其高传染性已造成全球大流行。目前关于SARS-CoV-2依赖内吞途径进入细胞的研究偏向于药物抑制实验或固定样品的蛋白共定位实验,而对于其入胞时与细胞内吞结构相互作用的动力学机制研究较少。本研究首先基于慢病毒系统包装出可在生物安全二级实验室(BSL-2)进行操作的SARS-CoV-2假病毒,之后利用膜染料对假病毒的囊膜进行荧光标记,并进行鉴定。通过免疫荧光方法观察到假病毒与网格蛋白包被的内吞结构共定位,进一步在网格蛋白敲低的Caco-2细胞系上进行假病毒感染,检测到荧光素酶活性显著下降,这些结果确定了网格蛋白介导的内吞作用参与假病毒感染。最后基于单病毒示踪技术,通过共聚焦显微镜对假病毒入胞过程进行活细胞实时拍摄,选取两个具有代表性的假病毒粒子依赖网格途径入胞的典型视野,并对假病毒动力学进行分析。本研究成功建立了SARS-CoV-2假病毒入胞活细胞示踪平台,可应用于研究单个假病毒粒子入胞过程动力学机制。该平台对SARS-CoV-2入胞机制的研究具有重大意义。; 李宇哲李阳阳沈熹涓刘斐单衍可; 关键词：假病毒

大肠杆菌表达的RNA解螺旋酶Ded1p的提纯与解螺旋机制被引量：1: 2017年; [目的]表达、提纯DEx H/D-box家族蛋白Ded1p,并综合传统电泳以及单分子荧光共振能量转移(sm FRET)技术,探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[方法]原核表达、纯化出全长的Ded1p作为研究蛋白,并验证其解螺旋酶活性。以荧光对标记的带有3'末端单链RNA尾巴的13 bp双链RNA作为研究底物,基于全内反射的单分子荧光共振能量转移技术,在自制的样品通道内添加800 nmol·L-1Ded1p、2 mmol·L-1ATP/Mg2+以及研究底物进行解螺旋试验,再用自编的Matlab程序采集和分析数据,进而从单分子层面探究Ded1p的双链RNA解螺旋机制。[结果]首次通过Ni-NTA凝胶亲和层析与Capto-DEAE凝胶阴离子交换层析两步纯化手段,得到了大量纯净的、并且具有双链RNA解螺旋酶活性的Ded1p。Ded1p的sm FRET试验在单分子层面实现了对Ded1p打开13 bp双链RNA过程的实时观察。通过分析FRET的变化过程,首次提出Ded1p主要以一步解螺旋的方式打开双链RNA结构。[结论]原核表达、纯化的Ded1p具有RNA解螺旋酶活性;该Ded1p是以局部双链打开的模式解开RNA双链。; 赵富林徐明飞谢青云单衍可雷静施志玉孙海凤刘斐

适合早期诊断的非洲猪瘟sIgA抗体量子点免疫层析检测方法建立被引量：2: 2023年; 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种烈性猪传染病,其极高的传染性和发病率给养猪产业造成了巨大的经济损失。目前尚无安全有效的ASF疫苗,因此早期监测是防控ASF最重要的解决方案之一。建立敏感、快速的ASF现场即时检验方法,对维护生猪产业繁荣具有重要意义。首先基于氨基和羧基的偶联反应制备量子点微球(quantum dot microsphere,QDM)偶联ASFV重组抗原蛋白p30的检测探针和QDM-兔抗鸡IgY质控探针;接着在检测线和质控线分别固定鼠抗猪IgA-Sc片段抗体和鸡IgY蛋白制备侧向流免疫试纸条;待检动物口腔液中的ASF sIgA抗体经QDM-p30捕获可被固定至T线。将ASFV阳性口腔液以2倍梯度稀释,检测该方法的灵敏度。通过检测其他几种常见猪病病毒验证该方法的特异性。通过检测ASFV阴性和阳性动物的口腔液临床样本评价该方法的临床诊断效能。该方法特异性好,与PRV、CSFV、PRRV不存在交叉反应;灵敏度高,最低检出稀释度可达1∶64;耗时短,可在20 min内完成检测;操作便捷,无需侵入式采样;检出时间早,人工感染最早可于感染后第6天检出。本研究开发了一种口腔液中ASF sIgA抗体的现场即时检验(point-of-care testing,POCT)量子点免疫试纸条,为ASFV的监测和防控提供了新的技术支持和补充。; 谢青云易玮婕李嘉豪白昀谢星袁厅张越张越赵东明赵东明步志高刘斐; 关键词：非洲猪瘟

三丁酸甘油酯和氧化苦参碱对肉仔鸡生长性能、血清生化指标及肠道健康的影响被引量：5: 2022年; 旨在研究三丁酸甘油酯和氧化苦参碱及其复合物对肉仔鸡生长性能、血清指标、抗氧化能力和肠道形态结构的影响。选取1日龄爱拔益加(AA)肉鸡公雏250只,随机分为5组,每组5个重复,每个重复10只。对照组(CON)饲喂基础饲粮,三丁酸甘油酯组(TBP)在基础饲粮中添加1 000 mg/kg三丁酸甘油酯制剂,氧化苦参碱组(OMP)在基础饲粮中添加1 000 mg/kg氧化苦参碱制剂,复合组(TBP+OMP)在基础饲粮中添加1000 mg/kg三丁酸甘油酯和氧化苦参碱复合制剂,抗生素组(CTC)在基础饲粮中添加50 mg/kg金霉素,试验期为21 d。结果显示:与对照组相比,三丁酸甘油酯和氧化苦参碱复合组肉仔鸡平均日增重显著升高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05);与抗生素组相比无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,复合组显著升高血清HDL-C含量(P<0.05),降低TG含量(P<0.05)。与对照组和抗生素组相比,复合组提高血清和肠黏膜中总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低丙二醛(MDA)的积累,对过氧化氢酶(CAT)活性无显著影响(P>0.05)。与对照组相比,复合组和抗生素组均显著提高十二指肠绒毛高度以及绒毛高度/隐窝深度比,降低隐窝深度(P<0.05);复合组空肠绒毛高度/隐窝深度比显著低于其他组(P<0.05)。结果表明:日粮添加三丁酸甘油酯和氧化苦参碱复合物能够提高肉仔鸡生长性能,改善血清生化指标,增强机体抗氧化能力,改善肠道形态结构,从而促进肉仔鸡的生长发育。; 金慧琴赵冬杜旭彬单衍可刘斐; 关键词：氧化苦参碱血清生化指标抗氧化能力肠道形态

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刘斐

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