李坤
- 作品数：8 被引量：16H指数：1
- 供职机构：成都生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：“重大新药创制”科技重大专项国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 全人源抗体基因库的构建及抗表皮生长因子受体单链抗体的筛选
- 2016年
- 目的从肿瘤患者外周血中构建全人源单链可变区抗体基因库，并采用真核核糖体展示技术高效筛选全人源抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单链抗体。方法采用PCR技术从52例晚期肿瘤患者外周血中构建大容量的全人源抗体基因库。针对EGFR抗原靶标，应用真核核糖体展示技术对该基因库进行高效富集筛选。通过大肠埃希菌表达体系对回收的基因库进行克隆、表达，并鉴定抗体活性。结果构建的全人源抗体基因库库容估算为4．3×1013。分子。对该基因库进行3轮富集筛选后，获得EGFR富集的单链抗体基因库。对回收基因库进行克隆、表达，并随机鉴定了49个克隆，获得结合力为10-8～10-7mol／L的2株全人源抗EGFR单链抗体。结论利用肿瘤患者外周血，结合核糖体展示技术可以较快获得具有医用价值的全人源单链抗体。
- 余馨何勇智丛聪李坤代云见张勇侠何静王明蓉何明跃
- 关键词：基因文库单链抗体核糖体展示技术外周血
- 重组sTNFα-R1蛋白同义密码突变库的构建及筛选
- 2013年
- 目的:以重组肿瘤坏死因子-α受体1(sTNFα-R1)的基因序列为模板,构建同义密码突变库,在不改变原氨基酸序列的同时筛选获得目标蛋白产量提高的突变菌株。方法:分段设计并合成同义密码突变兼并引物,通过优化PCR反应条件,构建目的基因的完整同义密码突变库。突变库经双酶切插入到pET11(b)载体上,并电转至E.coli BL21(DE3)细胞中。阳性克隆经PCR鉴定后,细胞表达目标蛋白,应用SDS-PAGE等方法分析目标蛋白产量。结果:目的基因同义突变库的PCR扩增产物可见330bp的特征条带,突变库测序结果显示整个基因序列的第三位碱基发生预期的同义突变;完成了445株克隆筛选,针对其中产量高于对照组的45株克隆进行测序,获得42株基因序列不同但氨基酸序列未发生变化的克隆菌株,其同义密码突变阳性率高达93%;选择其中2株初筛产量较高的菌株进行放大验证,结果显示7#突变株的包涵体收率及目标蛋白相对百分含量明显高于对照株,其每升发酵液的目标蛋白总产量比对照株提高2.44倍,405#突变株比对照株提高1.44倍。结论:通过优化PCR反应条件成功构建了目标基因全序列的同义密码突变库,采用同义密码突变库技术途径,在不改变原氨基酸序列的前提下可以快速优化蛋白表达产量。
- 何静丛聪代云见李坤王明蓉
- 包涵体变复性技术研究进展被引量：13
- 2012年
- 现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白成为现实，这极大地促进了蛋白类产品的开发，尤其是重组蛋白药物的研发。日前非糖基化的重组蛋白表达多采用火肠杆菌的原核表达系统，该系统的突出特点是表达产物多以包涵体形式存在。与蛋白可溶性表达相比，包涵体具有产量高、蛋白稳定、容易纯化等优点，对毒性蛋白制备尤其适宜。因此，采用包涵体形式己成为规模制备重组蛋白产品的主要途径之一。
- 罗莉李坤王保成王明蓉
- 关键词：包涵体变复性原核表达系统现代生物技术重组蛋白表达可溶性表达
- 采用DoE设计方法优化可溶性肿瘤坏死因子I型受体蛋白的聚乙二醇修饰工艺被引量：1
- 2013年
- 目的 采用DoE设计方法对人可溶性肿瘤坏死因子I型受体（soluble tumour necrosis factorαreceptors I,sTNFα-R玉）的聚乙二醇（PEG）修饰工艺参数进行优化,以期获得稳定、可控的工艺参数。方法 采用UNICORN（DoE）软件中Central Composite Face Centered（CCF）模型对sTNFα-R玉的3个PEG修饰工艺参数,即溶液pH值（pH）、反应时间（Time）和PEG与蛋白质量比（PEGrate）进行优化,设置4个响应值（多PEG修饰蛋白峰面积、单PEG修饰蛋白峰面积、未修饰蛋白峰面积及单PEG修饰蛋白峰面积与多PEG修饰蛋白峰面积比值）揭示其化学反应过程,确定参数操作空间;应用蒙特-卡罗模拟法（Monte-Carlo Simulation）对优化参数进行风险评估。结果3因子17组试验结果的重复性较好,中心点重复组响应值介于最低值和最高值之间,且随机分布,符合DoE试验设计的要求;4个响应值所对应的回归系数（R2）均〉0.75,预测准确性（Q2）〉0.5,模型有效性（Model Validity）〉0.25,重复性（Reproducibility）〉0.5,模型预测与实验值之间偏差较小,具有可靠的预测准确性;17组试验结果标准残差在允许范围（-4～4）之间,线性较好,预测值与观测值之间相关性较好,建立的模型拟合度高,可较为准确地预测试验结果。溶液pH值对多PEG修饰产量影响较小,随着Time和PEGrate的升高,多PEG修饰产物增加,单PEG修饰产物经二次或多次修饰形成多PEG修饰产物,减少Time和PEG用量可减少多PEG修饰产物;单PEG修饰产物随着pH上升,产量有所增加,与Time呈二次项关系,在Time.PEGrate交互作用中,减少PEG用量可增加单PEG修饰产物量;减少Time和降低PEG用量可提高单PEG修饰产物与多PEG修饰产物的比值,有利于下游纯化。确定了工艺参数的操作空间,当pH为5.5时,反应时间控制在30 h以上,PEG与蛋白质量比控制在3.7以下,符合预设值;pH在6.5时,反应时间控制在22～35 h之间,PEG与蛋白质量
- 王保成蔡峰李坤李春阳张珂秦娇荣
- 关键词：肿瘤坏死因子Α受体PEG修饰DOE
- VEGF抗体及其制备方法和用途
- 本发明公开了VEGF单域抗体及其融合抗体和多聚体抗体。本发明还公开了编码前述抗体的核苷酸序列，包含该核苷酸序列的表达载体、重组菌以及前述抗体的制备方法和用途。本发明VEGF抗体分子量小，可塑性高，具有广泛的应用前景。
- 何勇智丛聪代云见张勇侠李坤李春阳王保成秦娇荣赵兆王明蓉何明跃
- 文献传递
- 重组人肿瘤坏死因子受体Ⅰ蛋白复性过程中巯基浓度的监测被引量：1
- 2013年
- 目的建立一种在重组人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（tumor necrosis factor receptorⅠ，TNFRⅠ）蛋白复性过程中简单、可靠且易于操作的巯基浓度的监测方法，用以指导、监控蛋白复性过程及终点判断。方法通过测定3种不同巯基浓度检测方法的线性范围及相关系数，建立适合重组人TNFRI蛋白复性溶液中巯基浓度的测定方法；动态监测蛋白复性过程中溶液巯基浓度变化及巯基浓度与复性蛋白生物活性的相关性；于蛋白复性48、96和144h取样，检测4℃保存3d和6d的稳定性。结果采用的3种巯基浓度监测方法中，方法3标准偏差值（standard error value，STDEV）较小，线性范围在0～12．5mmol／L，线性关系较好，R^2=0．9999，更适于蛋白复性溶液中巯基浓度的监测；随着蛋白复性时间的延长，巯基浓度呈明显的下降趋势（R^2=0．9891），当浓度在2～1mmol／L下降期间，是复性蛋白细胞活性上升最快期，而当巯基浓度降至1mmol／L及以下时，细胞活性达到最大值；蛋白复性144h后，细胞活性较为稳定。结论建立了一种简单、可靠且易于操作的巯基浓度测定方法，该方法对提高包涵体的复性效率具有重要的参考价值。
- 王保成李坤李春阳蔡峰秦娇荣
- 关键词：蛋白质复性巯基细胞活性
- ELISA法测定大鼠血清中聚乙二醇化重组蛋白(PEG-SOP55)浓度及药代动力学研究被引量：1
- 2016年
- 目的:建立一种检测大鼠血清中聚乙二醇化重组蛋白(PEG-SOP55)浓度的ELISA方法,并进行该蛋白的药代动力学初步研究。方法:以该蛋白的多抗包被,标记生物素的单抗检测,生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶两级酶联放大检测信号,构建双抗夹心ELISA法进行浓度检测。通过对包被抗体和检测抗体工作浓度的优化实验,血清基质的干扰实验,不同结构聚乙二醇分子的比较实验,建立该方法的基本实验条件。并参考相关法规,对其方法特异性、准确度、精密度、耐用性、检测限度以及样品稳定性进行验证。分别用PEG-SOP55_(30kDa)、PEG-SOP55_(40kDa)、PEG-SOP55_(40kDa branched)进行Lewis大鼠腹腔单次给药然后测定血清浓度,获得该蛋白用不同分子结构聚乙二醇分子修饰后的药代动力学参数。结果:实验证实聚乙二醇修饰降低了检测抗体和目标分子的结合效率,且大鼠血清和聚乙二醇分子结构变化对检测有干扰。通过提高包被抗体浓度,获得对目标分子较好的捕获效率。通过将血清样品稀释液从PBS替换为咪唑缓冲液,且保持标准曲线和待测样品血清稀释倍数一致,克服了血清基质所带来的干扰。通过保持标准曲线和待测样品聚乙二醇分子结构一致,克服了因聚乙二醇分子结构不同带来的干扰。方法验证结果表明该方法特异性良好,回收率为(100±15.2)%,实验内精密度和实验间精密度验证数据RSD均不超过20%,不同操作人员对检测结果无显著影响,标准曲线线性良好,标准曲线的最高和最低浓度能够准确测定。将大鼠血清样品反复冻融3次,在室温放置4 h其稳定性均符合要求,满足该方法检测条件。通过对Lewis大鼠血清样品进行浓度测定,获得PEG-SOP55_(30kDa)、PEG-SOP55_(40kDa)、PEG-SOP55_(40kDa branched)的药代动力学参数。其C_(max)分别为31.9、54.4、67.7 mg·m L^(-1),AUC_(0-∞)分别为823.0、1 978.0、3 502.6 mg·h·m L^
- 张涛何静李坤王明蓉
- 关键词：聚乙二醇化重组蛋白药代动力学
- 乙型脑炎减毒活疫苗生产用地鼠易感病毒ELISA检测方法的优化及验证
- 2015年
- 目的对乙型脑炎减毒活疫苗生产用地鼠易感病毒ELISA检测方法进行优化,并对该方法进行验证。方法将ELISA方法进行优化后,检测地鼠血清中的呼肠孤病毒3型(reovirus 3,Reo3)、小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)、仙台病毒(Sendai virus,SV)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV),验证该方法的重复性、中间精密性及特异性,并根据WHO/VSQ/97.02的要求,制定验证参数的可接受标准。结果优化后的ELISA方法具有良好的重复性、中间精密性及特异性,各项验证参数均达到预先设定的可接受标准。结论该方法可用于乙型脑炎减毒活疫苗的质量控制。
- 唐溯杨锣徐永革李坤潘海龙孟丽
- 关键词：乙型脑炎减毒活疫苗酶联免疫吸附试验
