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Marc145细胞SHP-1、SHP-2结构域的克隆表达及抗体的制备与纯化: 目的为了验证Marc145细胞SHP-1、SHP-2的存在,克隆出Marc 145细胞SHP-1、SHP-2结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体.材料与方法应用RT-PCR技术从Mar...; 杜东颖崔春晓冯亚琼王冬梅郭嘉张莹莹夏平安

PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达被引量：4: 2019年; 参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。; 许瑞勤郭嘉魏凤灵冯延马思续张留君李想通李闻孙杨杨杨国宇夏平安张改平; 关键词：PRRSV GP5 杆状病毒表达系统真核表达

CD163分子在PRRSV免疫复合物感染PAM细胞过程中的作用被引量：3: 2015年; 目的研究CD163分子在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)免疫复合物感染肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophage cells,PAMs)中的作用。方法将纯化的PRRSV特异性Ig G做4倍稀释后与等体积的TCID50为104.6/0.1 ml PRRSV混合,制成感染性免疫复合物。分别用鼠抗猪CD163-P1、CD163-P2、CD163-P3、CD163-P4和CD163-H抗体组封闭PAM细胞,然后将感染性免疫复合物感染封闭后的PAM细胞同时设鼠阴性Ig G封闭组和感染性免疫复合物组作对照。分别培养24 h和48 h后裂解PAM细胞提取RNA,用已建立的PRRSV实时荧光定量PCR方法检测PRRSV拷贝数,并用Graph Pad Prism 5软件处理所得到的数据。结果在免疫复合物处理24 h和48 h时,鼠抗猪CD163-P1和CD163-P2抗体封闭组的PRRSV m RNA拷贝数与相应的鼠阴性Ig G对照组比较均差别不大;鼠抗猪CD163-P3抗体组的PRRSV增殖水平均却显著低于对照组,且鼠抗猪CD163-P3抗体封闭组在24 h时间段的PRRSV m RNA水平是鼠阴性Ig G对照组的0.87倍,在48 h时是对照组的0.75倍(P<0.01);鼠抗猪CD163-P4抗体组的PRRSV m RNA拷贝数均低于鼠阴性Ig G对照组,但差异不显著;而鼠抗猪CD163-H抗体组PRRSV m RNA拷贝数均显著低于鼠阴性Ig G对照组,在24 h时PRRSV m RNA水平是鼠阴性Ig G对照组的0.88倍(P<0.05),在48 h时是对照组的0.83倍(P<0.05)。结论鼠抗猪CD163抗体能够阻碍PRRSV的增殖,且鼠抗猪CD163-P3抗体具有显著的抑制作用。; 冯亚琼崔春晓夏禹豪张莹莹郭嘉秦运杰夏平安; 关键词：PRRSV 免疫复合物

Sn在PRRSV免疫复合物感染PAM细胞中的作用被引量：1: 2015年; 目的研究猪唾液酸黏附素(Sn)受体在抗体介导PRRSV感染PAM细胞中的作用。方法用已经纯化的猪抗PRRSV Ig G与TCID50104.6/0.1 ml的PRRSV Hn-3/06株等体积混合均匀制成感染性免疫复合物,用Sn Ig G和Sn Ig G+CD163 Ig G分别封闭PAM细胞,然后用感染性免疫复合物感染封闭后的PAM细胞,并设鼠阴性Ig G封闭组作对照,48 h后收集样品。用已建立的PRRSV SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR方法检测PRRSV的m RNA水平,并运用Graph Pad Prism 5软件处理数据。结果单独Sn封闭及联合封闭Sn和CD163后,PRRSV-Ig G组病毒含量不但没有升高,反而下降,且联合封闭下降更明显。结论 Sn受体可以在一定程度上调节感染性免疫复合物对机体的作用,对其进入宿主靶细胞具有协助和促进作用。; 崔春晓冯亚琼夏禹豪郭嘉张莹莹李娜娜夏平安张改平; 关键词：PRRSV SN 免疫复合物

CD163分子胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用被引量：2: 2016年; 目的研究猪CD163分子胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用。方法将实验室保存的PET-CD163-P1、PET-CD163-P2、PET-CD163-P3及PET-CD163-P4重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,以最佳IPTG诱导表达的时间和最适诱导表达的浓度,大量诱导表达CD163-P1、CD163-P2、CD163-P3和CD163-P4重组蛋白,并用不同浓度的尿素洗涤纯化重组蛋白,然后用紫外分光光度计测定蛋白浓度。用不加血清的1640营养液将各重组蛋白稀释为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/ml 5个不同的质量浓度,再分别与等体积的200个TCID_(50)/0.1 ml PRRSV病毒充分混匀后放置于37℃培养箱作用1 h,后用于感染PAM细胞,补加营养液作用48 h,同时设置单纯PRRSV感染对照组,用已建立的绝对荧光定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的拷贝数,并用Graph Pad Prism 5软件对所得到的数据进行处理。结果 CD163各片段不同稀释度的结构域重组蛋白与PRRSV混合作用感染48 h后,PRRSV的拷贝数均明显低于PRRSV单纯感染PAM细胞组的拷贝数,并且重组蛋白质量浓度越高,竞争结合抑制作用越明显。其中,CD163-P1片段各个质量浓度的结构域重组蛋白的竞争结合抑制作用相比其它片段更明显。结论 CD163各片段不同稀释度的结构域重组蛋白与PAM细胞上的CD163受体胞外区结构域在与PRRSV结合时存在竞争作用,该竞争结合使PRRSV的增殖明显降低,并且CD163-P1结构域片段可能在参与PRRSV感染PAM细胞中发挥主要作用。; 张莹莹郭嘉冯延马思续刘中原冯亚琼张留君夏平安; 关键词：功能结构域重组蛋白 PRRSV

抗猪唾液素粘附素胞外区抗体的活性研究: 引言由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸综合征己成为危害全球养猪生产的重要经济性疫病之一.病毒侵染细胞的过程可分为吸附、侵入、脱壳、病毒各种组成成分的合成、病毒粒子的装配和释放等.但对于有囊膜的病毒而...; 杜东颖王冬梅冯亚琼崔春晓郭嘉张莹莹夏平安

Poly(I:C)对PRRSV诱导的抗病毒免疫反应的影响被引量：1: 2016年; 为了研究聚肌苷胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）诱导的抗病毒免疫反应的影响，本研究采用200个TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞（porcine alveolarmacro—phage，PAM），吸附1h后用100μg／L的聚肌苷胞（poly（I：C））处理细胞，分别培养12、24、36、48h后收集细胞及上清，同时设PRRSV感染对照组、poly（I：C）刺激对照组和健康细胞对照组，用实验室已经建立的Real—timeqPCR方法对poly（I：C）刺激PRRSV感染组和PRRSV感染对照组中PRRSV复制水平及各组PAM细胞中IFN-α、TNF-αmRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示，PRRSV在感染PAM细胞后12～24h期间可促进PAM细胞IFN—αmRNA的转录，36～48h期间抑制PAM细胞IFN—αmRNA的转录；TNF—αmRNA转录水平在12、48h后略微升高，在24、36h后均略微下降。Poly（I：C）处理PAM细胞后IFN—α、TNF-αmRNA转录水平均上调。Poly（I：C）＋PRRSV组IFN—αmRNA的转录水平与PRRSV组相比在12～36h均显著升高，在48h后则显著下调。Poly（I：C）＋PRRSV组TNF—αmRNA转录水平与PRRSV组相比，12～36h后均升高，在12h升高较显著，48h后则显著下调。结果表明，PRRSV感染PAM细胞经Poly（I：C）刺激后IFN—α、TNF-αmRNA转录水平在12～36h后显著升高，从而抑制了PRRSV在PAM细胞内的复制。; 王冬梅崔春晓冯亚琼张莹莹郭嘉杜东颖夏平安; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪肺泡巨噬细胞 IFN-Α

Marc145细胞SHP-1、SHP-2结构域的克隆表达及抗体的制备与纯化被引量：1: 2015年; 应用RT-PCR技术从Marc145细胞中克隆出SHP-1、SHP-2结构域基因的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-SHP-1、pET-SHP-2,转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下成功表达相对分子质量大小约为37 500、40 100的融合蛋白,将纯化过的融合蛋白分别免疫小鼠,制备鼠源血清,采用间接ELISA和Western Blot试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12 800;Western Blot试验结果证明,制备的鼠抗pET-SHP-1、pET-SHP-2多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。采用硫酸铵盐析与DE-52离子交换层析相结合的方法提取并纯化血清得到纯度较高的鼠抗SHP-1、SHP-2抗体IgG。结果验证了Marc145细胞SHP-1、SHP-2的存在,克隆出了Marc145细胞SHP-1、SHP-2结构域基因并成功表达,为后续试验和研究奠定了基础。; 杜东颖崔春晓冯亚琼王冬梅郭嘉张莹莹夏平安; 关键词：SHP-1 SHP-2 克隆原核表达多克隆抗体

Poly(I:C)对PRRSV诱导的抗病毒免疫反应的影响: 引言聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,polyI： C)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通过碱基互补配对形成的双链RNA,是一种高效干扰素诱导剂,1957年Isaacs和Lindenmann...; 王冬梅崔春晓冯亚琼张莹莹郭嘉杜东颖夏平安

针对不同形式猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白的抗体中和活性比较被引量：4: 2018年; GP5蛋白被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导中和抗体的主要蛋白,为探讨GP5蛋白诱导免疫保护的能力,本研究用杆状病毒/昆虫表达系统分别表达了全长和截短的GP5蛋白,同时用大肠杆菌表达系统表达了截短的GP5蛋白。三种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,以PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原检测抗血清时,原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶200,真核表达的全长GP5蛋白抗血清效价为1∶800,真核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶1 600。将获得的三种抗血清分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)进行PRRSV同源(PRRSV VR2332)和异源(PRRSV HeN-3)毒株的血清学中和试验,并通过实时定量PCR方法检测各组中PRRSV mRNA的绝对拷贝数,以抗血清的病毒阻断率≥70%的最大血清稀释度作为该血清的中和效价。结果显示:1)三种重组蛋白的抗血清对两种PRRSV毒株的中和效价均<1∶2,不具有中和活性,部分稀释滴度的血清还增强了病毒的感染;2)抗PRRSV全病毒对照阳性血清对同源毒株的中和效价为1∶8,具有中和活性;对异源毒株的中和效价<1∶2,不具有中和活性,同时还产生了ADE增强作用。上述研究结果提示,GP5的主要中和表位可能更多是构象表位,PRRSV全病毒中主要诱导中和抗体产生的蛋白可能并不完全在GP5蛋白上;PRRSV全病毒阳性抗血清虽然能够提供一定的免疫保护,但这种免疫保护只发生在同源毒株之间,对异源毒株并没有效果,反而会介导ADE效应发生。; 冯延郭嘉许瑞勤马思续魏凤灵张留君杨国宇夏平安张改平; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5 杆状病毒表达系统真核表达

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