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CD163分子在PRRSV免疫复合物感染PAM细胞过程中的作用被引量：3: 2015年; 目的研究CD163分子在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)免疫复合物感染肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophage cells,PAMs)中的作用。方法将纯化的PRRSV特异性Ig G做4倍稀释后与等体积的TCID50为104.6/0.1 ml PRRSV混合,制成感染性免疫复合物。分别用鼠抗猪CD163-P1、CD163-P2、CD163-P3、CD163-P4和CD163-H抗体组封闭PAM细胞,然后将感染性免疫复合物感染封闭后的PAM细胞同时设鼠阴性Ig G封闭组和感染性免疫复合物组作对照。分别培养24 h和48 h后裂解PAM细胞提取RNA,用已建立的PRRSV实时荧光定量PCR方法检测PRRSV拷贝数,并用Graph Pad Prism 5软件处理所得到的数据。结果在免疫复合物处理24 h和48 h时,鼠抗猪CD163-P1和CD163-P2抗体封闭组的PRRSV m RNA拷贝数与相应的鼠阴性Ig G对照组比较均差别不大;鼠抗猪CD163-P3抗体组的PRRSV增殖水平均却显著低于对照组,且鼠抗猪CD163-P3抗体封闭组在24 h时间段的PRRSV m RNA水平是鼠阴性Ig G对照组的0.87倍,在48 h时是对照组的0.75倍(P<0.01);鼠抗猪CD163-P4抗体组的PRRSV m RNA拷贝数均低于鼠阴性Ig G对照组,但差异不显著;而鼠抗猪CD163-H抗体组PRRSV m RNA拷贝数均显著低于鼠阴性Ig G对照组,在24 h时PRRSV m RNA水平是鼠阴性Ig G对照组的0.88倍(P<0.05),在48 h时是对照组的0.83倍(P<0.05)。结论鼠抗猪CD163抗体能够阻碍PRRSV的增殖,且鼠抗猪CD163-P3抗体具有显著的抑制作用。; 冯亚琼崔春晓夏禹豪张莹莹郭嘉秦运杰夏平安; 关键词：PRRSV 免疫复合物

Sn在PRRSV免疫复合物感染PAM细胞中的作用被引量：1: 2015年; 目的研究猪唾液酸黏附素(Sn)受体在抗体介导PRRSV感染PAM细胞中的作用。方法用已经纯化的猪抗PRRSV Ig G与TCID50104.6/0.1 ml的PRRSV Hn-3/06株等体积混合均匀制成感染性免疫复合物,用Sn Ig G和Sn Ig G+CD163 Ig G分别封闭PAM细胞,然后用感染性免疫复合物感染封闭后的PAM细胞,并设鼠阴性Ig G封闭组作对照,48 h后收集样品。用已建立的PRRSV SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR方法检测PRRSV的m RNA水平,并运用Graph Pad Prism 5软件处理数据。结果单独Sn封闭及联合封闭Sn和CD163后,PRRSV-Ig G组病毒含量不但没有升高,反而下降,且联合封闭下降更明显。结论 Sn受体可以在一定程度上调节感染性免疫复合物对机体的作用,对其进入宿主靶细胞具有协助和促进作用。; 崔春晓冯亚琼夏禹豪郭嘉张莹莹李娜娜夏平安张改平; 关键词：PRRSV SN 免疫复合物

Poly(I:C)对PRRSV诱导的抗病毒免疫反应的影响被引量：1: 2016年; 为了研究聚肌苷胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）诱导的抗病毒免疫反应的影响，本研究采用200个TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞（porcine alveolarmacro—phage，PAM），吸附1h后用100μg／L的聚肌苷胞（poly（I：C））处理细胞，分别培养12、24、36、48h后收集细胞及上清，同时设PRRSV感染对照组、poly（I：C）刺激对照组和健康细胞对照组，用实验室已经建立的Real—timeqPCR方法对poly（I：C）刺激PRRSV感染组和PRRSV感染对照组中PRRSV复制水平及各组PAM细胞中IFN-α、TNF-αmRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示，PRRSV在感染PAM细胞后12～24h期间可促进PAM细胞IFN—αmRNA的转录，36～48h期间抑制PAM细胞IFN—αmRNA的转录；TNF—αmRNA转录水平在12、48h后略微升高，在24、36h后均略微下降。Poly（I：C）处理PAM细胞后IFN—α、TNF-αmRNA转录水平均上调。Poly（I：C）＋PRRSV组IFN—αmRNA的转录水平与PRRSV组相比在12～36h均显著升高，在48h后则显著下调。Poly（I：C）＋PRRSV组TNF—αmRNA转录水平与PRRSV组相比，12～36h后均升高，在12h升高较显著，48h后则显著下调。结果表明，PRRSV感染PAM细胞经Poly（I：C）刺激后IFN—α、TNF-αmRNA转录水平在12～36h后显著升高，从而抑制了PRRSV在PAM细胞内的复制。; 王冬梅崔春晓冯亚琼张莹莹郭嘉杜东颖夏平安; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪肺泡巨噬细胞 IFN-Α

CD163分子胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用被引量：2: 2016年; 目的研究猪CD163分子胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用。方法将实验室保存的PET-CD163-P1、PET-CD163-P2、PET-CD163-P3及PET-CD163-P4重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,以最佳IPTG诱导表达的时间和最适诱导表达的浓度,大量诱导表达CD163-P1、CD163-P2、CD163-P3和CD163-P4重组蛋白,并用不同浓度的尿素洗涤纯化重组蛋白,然后用紫外分光光度计测定蛋白浓度。用不加血清的1640营养液将各重组蛋白稀释为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/ml 5个不同的质量浓度,再分别与等体积的200个TCID_(50)/0.1 ml PRRSV病毒充分混匀后放置于37℃培养箱作用1 h,后用于感染PAM细胞,补加营养液作用48 h,同时设置单纯PRRSV感染对照组,用已建立的绝对荧光定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的拷贝数,并用Graph Pad Prism 5软件对所得到的数据进行处理。结果 CD163各片段不同稀释度的结构域重组蛋白与PRRSV混合作用感染48 h后,PRRSV的拷贝数均明显低于PRRSV单纯感染PAM细胞组的拷贝数,并且重组蛋白质量浓度越高,竞争结合抑制作用越明显。其中,CD163-P1片段各个质量浓度的结构域重组蛋白的竞争结合抑制作用相比其它片段更明显。结论 CD163各片段不同稀释度的结构域重组蛋白与PAM细胞上的CD163受体胞外区结构域在与PRRSV结合时存在竞争作用,该竞争结合使PRRSV的增殖明显降低,并且CD163-P1结构域片段可能在参与PRRSV感染PAM细胞中发挥主要作用。; 张莹莹郭嘉冯延马思续刘中原冯亚琼张留君夏平安; 关键词：功能结构域重组蛋白 PRRSV

抗猪唾液素粘附素胞外区抗体的活性研究: 引言由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸综合征己成为危害全球养猪生产的重要经济性疫病之一.病毒侵染细胞的过程可分为吸附、侵入、脱壳、病毒各种组成成分的合成、病毒粒子的装配和释放等.但对于有囊膜的病毒而...; 杜东颖王冬梅冯亚琼崔春晓郭嘉张莹莹夏平安

Marc145细胞SHP-1、SHP-2结构域的克隆表达及抗体的制备与纯化: 目的为了验证Marc145细胞SHP-1、SHP-2的存在,克隆出Marc 145细胞SHP-1、SHP-2结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体.材料与方法应用RT-PCR技术从Mar...; 杜东颖崔春晓冯亚琼王冬梅郭嘉张莹莹夏平安

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的ITIM基序对IFN-β产生的正调节作用: 2018年; 为了研究PRRSV M蛋白的ITIM基序对IFN-β产生的激活机制,以PRRSV Hn-1/06毒株c DNA为模板扩增ORF6基因片段,分别构建了重组质粒pcDNA3. 0-GP6、pcDNA3. 0-GP6△ITIM(缺失ITIM基序)。将重组质粒分别转染Marc-145细胞,用荧光定量PCR方法检测TRIF、MyD88、TRAF6、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-β的mRNA转录水平;结果表明,pcDNA3. 0-GP6组与pcDNA3. 0-GP6△ITIM组相比:TRIF、IRF3、IRF7 mRNA转录水平上调(此处为总体趋势,个别时间点可能不完全相符,下同),MyD88、TRAF6 mRNA转录水平下调。分别将重组质粒和Poly(I:C)共转染Marc-145细胞,检测TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-βmRNA转录水平;结果表明,pcDNA3. 0-GP6组与pcDNA3. 0-GP6△ITIM组相比,TRIF、IRF3、IRF7 mRNA转录水平上调,NF-κB、IFN-βmRNA转录水平在36 h上调。将SHP-1-siRNA-781、SHP-2-siRNA-1335分别与pcDNA3. 0-GP6、pcDNA3. 0-GP6△ITIM重组质粒共转染Marc-145细胞,通过荧光定量PCR方法检测TRIF、IRF3、IRF7、NF-κB和IFN-βmRNA转录水平;结果表明,沉默SHP-1后,pcDNA3. 0-GP6组与pcDNA3. 0-GP6△ITIM组相比,TRIF、IRF3、IRF7和IFN-βmRNA转录水平12 h后显著下调;而沉默SHP-2后,TRIF、IRF3、NF-κB、IFN-βmRNA转录水平均为先升高再降低,后趋于稳定,而IRF7 mRNA转录水平被持续上调到48 h。M蛋白的ITIM基序可能通过调节TLR3-TRIF依赖型信号通路激活IFN-β的产生; SHP-1在M蛋白的ITIM基序激活Ⅰ型干扰素的信号传导途径中可能起关键调节作用,而ITIM基序与SHP-2的关系还需要进一步探索。本试验结果为进一步明确ITIM基序的作用机制提供参考。; 魏凤灵张莹莹许瑞勤李闻李想通孙杨杨张留君杨国宇夏平安张改平; 关键词：M蛋白 IFN-Β

猪唾液素黏附素胞外区在PRRSV感染PAM细胞中的作用被引量：1: 2015年; 采用新的试验方法制备出纯度较高的抗猪Sn的鼠纯化IgG,并证实此种抗体可以阻碍PRRSV感染PAM,为研究猪Sn各结构域的作用提供参考,为进一步研究PRRSV侵入宿主的作用机制奠定基础。本试验分8个片段克隆猪Sn胞外区功能结构域（第2-17结构域）,并分别构建重组表达质粒,转化到BL21进行诱导表达。通过优化蛋白表达条件,制备其重组蛋白,将8种重组蛋白混匀后制成混合抗原（SnE）免疫小鼠以制备其多克隆抗体血清,用间接ELISA的方法检测高免血清的效价,分离并收集血清。采用硫酸铵盐析与DE-52离子交换层析相结合的方法提取并纯化血清,得到纯度较高的鼠抗猪SnE抗体。无菌灌冲猪肺脏收集原代PAM至24孔培养板中,培养6h后,用抗Sn150（第1结构域）、SnE和Sn150＋SnE等抗原的鼠纯化IgG以及鼠阴性IgG和PBS分别处理PAM,1h后用200CID50PRRSV感染PAM,分别在感染24、48h后用已建立的PRRSV实时荧光定量PCR方法检测感染细胞的病毒拷贝数。结果显示,PRRSV感染24h和48h时后,鼠抗猪Sn150抗体组的PRRSV mRNA拷贝数与阴性IgG组相比较均差异较小（P〉0.05）;而鼠抗猪SnE抗体和Sn150＋SnE混合抗体组的PRRSV mRNA拷贝数均显著低于对应的阴性IgG组,且鼠抗猪SnE抗体组24h和48h时PRRSV mRNA拷贝数分别是阴性IgG组的0.75倍（P〈0.001）和0.74倍（P〈0.001）,Sn150＋SnE混合抗体组24h和48h时的PRRSV mRNA拷贝数分别是阴性IgG的0.83倍（P〈0.01）和0.76倍（P〈0.001）。结果表明,鼠抗猪SnE抗体和Sn150＋SnE混合抗体封闭后PRRSV感染PAM的能力降低,且效果显著,提示PRRSV的吸附和内吞作用可能与pSn整个胞外区都有密切的关系。; 秦运杰李娜娜王冬梅崔春晓冯亚琼杜东颖张莹莹杨青原杨明凡夏平安张改平; 关键词：多克隆抗体 PRRSV

SHP1在PRRSV诱导的抗病毒免疫反应中的作用被引量：3: 2017年; 为了探究SHP1在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)诱导的抗病毒免疫中的作用,本研究采用200个TCID50的PRRSV感染猪肺巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM),分别培养12,24,36,48h后收集细胞及上清,分别设正常细胞对照组,聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,polyI:C)刺激对照组,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激对照组。采用ELISA方法检测PRRSV感染的PAM培养上清中SHP1的蛋白表达情况。用实验室已经建立的实时荧光定量PCR方法对PRRSV感染组和各个对照组PAM细胞中IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1和IFN-β的mRNA转录水平变化进行定量分析。结果显示:激活的SHP1对PRRSV感染后PAM中IRF7、NF-kB和IFN-β的转录有促进作用,对IRF3和TRAF6的转录有抑制作用。LPS及Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM细胞均促进了IRF3、IRF7、TRAF6、NF-κB、SHP1和IFN-β的转录。结果表明,激活的SHP1会通过TLR介导的信号通路或未知通路来调节PRRSV诱导的抗病毒免疫反应水平。LPS和Poly(I:C)刺激PRRSV感染的PAM细胞能够增强抗病毒细胞因子的转录水平。; 王冬梅郭嘉张莹莹冯亚琼崔春晓杜东颖夏平安; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒脂多糖

Poly(I:C)对PRRSV诱导的抗病毒免疫反应的影响: 引言聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,polyI： C)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通过碱基互补配对形成的双链RNA,是一种高效干扰素诱导剂,1957年Isaacs和Lindenmann...; 王冬梅崔春晓冯亚琼张莹莹郭嘉杜东颖夏平安

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张莹莹

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