何亚鹏
- 作品数：24 被引量：74H指数：4
- 供职机构：西北农林科技大学更多>>
- 发文基金：陕西省科技攻关计划中央级公益性科研院所基本科研业务费专项陕西省科技统筹创新工程计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 山羊痘病毒疫苗株ORF103基因的克隆、序列分析及原核表达被引量：4
- 2016年
- 根据GenBank已登录的GTPV基因组序列,设计并合成1对特异性引物,以GTPV疫苗株基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF103基因片段并进行序列分析,再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-ORF103,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDSPAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35ku的重组蛋白,该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料,并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。
- 鲍长磊何亚鹏张琪许信刚张彦明付明哲
- 关键词：山羊痘病毒基因克隆原核表达
- 猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌多重PCR检测方法的建立及应用被引量：4
- 2017年
- 为建立在临床样本能够同时检测猪种、牛种、羊种、绵羊种布鲁菌的多重PCR方法,根据NCBI已收录的布鲁菌全基因,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立能够同时检测4种布鲁菌的多重PCR诊断方法。特异性试验结果表明,可以从4种布鲁菌以及4种细菌混合物中扩增出大小分别为276、494、733和976bp的特异性条带,对照组的检测结果为阴性;敏感性试验结果表明,对4种病原菌基因组DNA的检出量为猪种32.2pg、牛种21.3pg、羊种27.5pg、绵羊种43.2pg;人工模拟感染样本检测结果表明,能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。应用该方法对200份临床奶山羊乳样进行检测,结果检出4份阳性。建立的多重PCR方法具有特异性强、敏感度高、稳定性好的特点,可以有效地检测4种布鲁菌的感染。
- 何亚鹏许信刚付明哲张琪
- 基于N蛋白的PPRV间接ELISA检测方法的建立及应用被引量：5
- 2017年
- 【目的】原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)的N蛋白,并以N蛋白为包被抗原建立血清间接ELISA检测方法。【方法】克隆PPRV N蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a中进行重组N蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化复性,并进行Western-blot鉴定。用复性后的N蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清中PPRV抗体水平的间接ELISA检测方法,并对其进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后用该方法对临床样品进行检测,检验其应用效果。【结果】原核表达获得大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot分析表明重组蛋白具有良好的特异性和反应原性。PPRV间接ELISA法优化反应条件为:抗原包被量每孔400ng,血清以1∶200倍稀释作用2h,酶标二抗以1∶8 000倍稀释作用1h,TMB显色时间20min,在该优化条件下,OD450≥0.309为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,该条件下对羊痘、羊口疮、羊布氏杆菌和羊魏氏梭菌血清检测结果均为阴性;对80份阳性血清进行检测,敏感性为98.7%。重复性试验表明,批内和批间OD450值的变异系数分别在2.29%~8.65%和2.13%~5.68%。用本试验建立的ELISA检测体系对临床197份血清进行检测,阳性率为85.79%,与标准试剂盒的符合率为96.4%。【结论】建立的ELISA检测方法可用于PPRV抗体水平的有效检测。
- 庞文静付明哲张琪何亚鹏许信刚
- 关键词：小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达间接ELISA
- 羊布氏杆菌陕西分离株OMP19基因的克隆、序列分析及原核表达
- 对羊布氏杆菌(Brucella)陕西分离株OMP19基因进行克隆、序列分析及原核表达.利用GenBank中收录的布氏杆菌(KT229642.1)OMP19基因序列,设计合成引物,应用PCR技术扩增OMP19基因,并将OM...
- 付明哲吴浩阳何亚鹏许信刚
- 关键词：布氏杆菌克隆原核表达
- FMDV、BTV、PPRV多重RT-PCR检测方法的建立被引量：1
- 2017年
- 为建立能够同时检测并鉴别口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)、蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)和小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)感染的多重RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应,Reverse transcription-polymerase chain reaction)方法,根据3种病毒的基因组全序列和保守区序列设计3对特异性引物,优化反应体系和扩增条件,建立能够同时检测3种病毒的多重RT-PCR方法。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法敏感性强,对FMDV、BTV和PPRV的核酸最低检测量分别为15.42、6.29、16.50ng/μL;特异性试验结果表明所建立方法的特异性良好。建立的多重RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、快速简便等特点,可以用于临床上3种病毒感染的诊断和鉴别。
- 何亚鹏张琪徐丽美庞文静付明哲许信刚
- 关键词：蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒多重RT-PCR
- 山羊地方性鼻内肿瘤病毒gag蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备被引量：4
- 2017年
- 为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)gag蛋白和抗gag蛋白的多克隆抗体,根据GenBank已登录的ENTVgag基因序列,设计合成1对特异性引物,应用PCP扩增gag基因并连接于原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-gag,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达相对分子质量约为69 000的重组蛋白,重组蛋白经镍柱亲和层析纯化、尿素梯度透析复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western blot试验表明,重组蛋白能与制得的多克隆抗体反应,而与正常小鼠血清和山羊地方性鼻内肿瘤患羊血清不反应。本试验成功获得了纯化的ENTV gag蛋白和小鼠抗gag蛋白的多克隆抗体,为进一步研究gag蛋白在ENTV致病过程中的作用提供了材料。
- 何亚鹏张琪王景周曼付明哲许信刚
- 关键词：GAG蛋白原核表达多克隆抗体
- 羊口疮病毒陕西分离株B2L基因的克隆、序列分析及原核表达被引量：2
- 2016年
- 为了对羊口疮病毒(ORFV)陕西分离株B2L基因进行克隆、序列分析及原核表达,根据GenBank已登录的ORFV(JN565694.1)B2L基因序列,设计合成一对特异性引物,应用PCR技术扩增ORFV B2L基因,并将目的基因连接到原核表达载体pET-28a中,成功构建重组质粒PET28a-B2L,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,成功克隆了ORFV陕西分离株B2L全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株B2L基因与国内外已报道的ORFV毒株核苷酸同源性超过97.3%,氨基酸同源性超过95.0%。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为42ku的重组蛋白,该蛋白能与羊口疮阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为ORFV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研制ORFV单克隆抗体及抗体检测ELISA试剂盒奠定了基础。
- 何亚鹏张琪庞文静徐丽美付明哲许信刚
- 关键词：羊口疮病毒B2L基因克隆原核表达
- 陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒S、M和N基因的遗传变异分析被引量：2
- 2016年
- 为了解陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传和变异情况,采集陕西省部分地区规模化猪场的5份疑似PEDV感染的猪小肠内容物,进行PEDV S、M和N基因的RT-PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定和遗传变异分析。结果表明,5份病料均能扩增出PEDV S、M和N基因,5株病毒分别命名为SXSL、SX-BJ、SX-YL、SX-WN和SX-HZ株。序列分析表明,5株毒株之间的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为96.7%～99.8%、98.4%～100%和97.2%～99.9%;氨基酸序列的同源性分别为97.4%～99.9%、98.2%～100%和98.2%～100%。该5株病毒与中国疫苗株CV777的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为93.9%～99.8%、98.1%～100%和95.3%～99.9%,氨基酸序列的同源性为93.6%～99.9%、96.2%～100%和98.2%～100%。遗传进化分析结果显示,5个陕西分离株的S基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远,与近年来中国株、日本株以及韩国株亲缘关系较近。SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较近,且与中国株CHGD-01亲缘关系密切。SX-WN株和SX-HZ株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远。该5株病毒的S基因以及SX-WN株和SX-HZ株的M基因和N基因变异程度较大,而SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株三个流行株均与中国株CHGD-01亲缘关系密切,并且与近年在陕西省流行的PEDV也不完全相同。
- 庞文静何亚鹏付明哲许信刚郭抗抗张琪
- 关键词：猪流行性腹泻病毒S基因M基因N基因
- 羊布鲁菌陕西分离株OMP19基因的克隆、序列分析及原核表达被引量：2
- 2017年
- 对羊布鲁菌(Brucella)陕西分离株OMP19基因进行克隆、序列分析及原核表达。利用GenBank中收录的布鲁菌(KT229642.1)OMP19基因序列,设计合成引物,应用PCR技术扩增OMP19基因,并将OMP19基因连接到原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET28a-OMP19,转化到BL21感受态细胞进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法分析。结果克隆了羊布鲁菌陕西分离株OMP19全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株OMP19基因与国内外已报道的羊布鲁菌核苷酸同源性超过98%,氨基酸同源性超过98%。OMP19重组菌经诱导表达约为19ku的重组蛋白,该蛋白能与本实验室鉴定保存的阳性血清特异性结合,反应原性良好。为羊布鲁菌陕西分离株分子生物学特性研究提供资料,为进一步进行基因工程疫苗研制及ELISA试剂盒抗体检测提供了基础。
- 吴浩阳吴浩阳何亚鹏付明哲孙裴
- 关键词：布鲁菌克隆原核表达
- 小反刍兽疫病毒疫苗株N和M基因的克隆、序列分析及原核表达被引量：4
- 2017年
- 根据GenBank已登录的PPRV基因组序列,设计并合成2对特异性引物,以PPRV疫苗株基因组为模板,经RT-PCR扩增获得N和M基因并进行序列分析,再将2个基因插入到原核表达载体pET-28a中,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot检测。成功克隆PPRV疫苗株N和M基因,重组菌经IPTG诱导后表达分子质量为57.7ku N蛋白(核衣壳蛋白)和38.1ku的M蛋白(基质蛋白),2个蛋白均能与小反刍兽疫阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。
- 何亚鹏鲍长磊张琪付明哲许信刚
- 关键词：N基因M基因克隆原核表达
