杜丽丽
- 作品数：6 被引量：8H指数：2
- 供职机构：河南农业大学更多>>
- 发文基金：河南省科技攻关计划引进国际先进农业科技计划国家自然科学基金更多>>
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- 猪MB21D1基因的克隆与原核表达
- cGAMP合成酶(即cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS),因其基因含有MBA-21结构域,故又被称为MB21D1(MA...
- 杜丽丽钟凯杨国宇王江张超郭豫杰
- 猪cGAS基因的克隆与原核表达被引量：2
- 2016年
- 【目的】环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶,能够识别胞质DNA,催化ATP和GTP生成第二信使c GAMP,继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3,启动机体固有免疫。通过构建含猪c GAS基因的重组质粒p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS,进行原核表达,得到c GAS蛋白,为进行体外催化合成c GAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏c DNA为模板克隆猪c GAS的蛋白编码区(open reading frame,ORF),用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-LIC中。菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序。将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。当细菌生长到对数期时,丙酸钠诱导表达His6-Nus A-c GAS融合蛋白,用20 mmol·L^(-1)丙酸钠在20℃,180 r/min分别诱导0、2、4、6、8、10 h,以确定最佳诱导时间;然后,分别用0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L^(-1)的丙酸钠在20℃,180 r/min诱导6 h,以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度;另外,分别在20℃,30℃,37℃条件下用20 mmol·L^(-1)丙酸钠,180 r/min培养6 h,以确定最佳诱导温度。筛选最佳诱导条件,并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。【结果】(1)本试验成功克隆了猪c GAS基因,其ORF长度为1 494 bp;(2)构建了c GAS丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS;(3)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L^(-1)丙酸钠,诱导6 h时表达量最高。(4)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为111.87 k D。【结论】运用大肠杆菌表达系统成功表达了c GAS融合蛋白,本试验为体外表达c GAS融合蛋白提供技术方法。
- 杜丽丽樊爽爽李赛赛陈佩格陈磊孙士平樊文杰王江王月影钟凯
- 关键词：原核表达
- 猪EP1基因的克隆与原核表达
- <正>在胰脏和小肠生长与修复过程中,上皮细胞表达的Epithelial progenitor(EP1)蛋白是一种细胞表面蛋白,其与细胞的管状形变关系密切。为进一步研究EP1基因所编码蛋白质的生物学功能,本实验设计一对引物...
- 杜丽丽钟凯杨国宇鲁维飞韩立强朱河水王江
- 文献传递
- 猪干扰素调节因子7的克隆及原核表达
- 2014年
- 为了进一步研究猪IRF7基因所编码蛋白质的生物学功能,本研究以猪十二指肠cDNA为模板扩增IRF7基因(RF区;将该基因克隆至原核表达载体pET-21b(+)中,获得pET-21b—IRF7重组质粒。经测序鉴定后,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达His—IRF7融合蛋白,并利用Western blot进行鉴定。结果表明:(1)成功克隆了1 461 bp IRF7 ORF区;(2)His—IRF7融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为60.5ku。结果提示,运用大肠杆菌表达系统成功表达IRF7融合蛋白,为猪IRF7基因相关功能研究提供了基础材料。
- 张雪梅杜丽丽刘福涛王江郭豫杰李宏基杨国宇
- 关键词：基因克隆原核表达
- 炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎性反应中的表达及miR-223真核表达载体的构建被引量：6
- 2016年
- 小分子RNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性、非编码单链小RNA,其在乳腺组织免疫防御过程中发挥的调控作用逐渐引起了人们的关注。作者拟用qRT-PCR检测炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应中的表达变化;构建3种miR-223真核表达载体并检验重组载体的转染效率。用不同浓度LPS处理小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)48h,qRT-PCR检测miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155的表达变化。以EpH4-Ev细胞基因组DNA为模板,PCR扩增pre-miR-223序列,以质粒Minicircle、pcDNA3.1(+)和转座子piggyBac为母本构建3种miR-223真核表达载体,将其转染EpH4-Ev细胞,通过观察荧光、qRT-PCR检测miR-223的表达,评价重组质粒转染效率。结果:qRT-PCR检测结果表明,LPS诱导EpH4-Ev细胞炎症反应时,4种炎症相关miRNAs的表达均显著(P<0.05或P<0.01)增加,并呈现不同程度的剂量依赖性;重组质粒转染EpH4-Ev细胞后,qRT-PCR检测结果显示,Mini-miR-223质粒转染组的miR-223表达水平无统计学差异(P>0.05);PBmiR-223和pcDNA-miR-223转染EpH4-Ev细胞后,miR-223的表达均极显著(P<0.001)增加。本研究表明炎症相关miRNAs参与LPS诱导小鼠EpH4-Ev细胞的炎性反应过程。成功构建3种miR-223真核表达载体,为后续miRNAs在乳腺炎症反应中的功能研究奠定基础。
- 郝俊芳黄凯王月影杜丽丽钟凯
- 关键词：乳腺上皮细胞真核表达载体乳腺炎
- 猪EP1基因的克隆与原核表达
- 2017年
- 为进一步体外研究EP1基因的生物学功能,本试验对EP1基因进行了组织分布分析。以猪骨髓cDNA为模板克隆了猪EP1基因的开放阅读框,对克隆的基因序列进行了序列分析,用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-LIC中。用菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序,将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。丙酸钠诱导表达His6-MBP-EP1融合蛋白,并用Western blot进行鉴定。结果显示:本试验成功克隆了猪EP1基因,长度为651bp,猪EP1基因在骨髓中的表达量很高;构建了EP1丙酸诱导型原核表达载体pBbB3a-His6-MBP-EP1;His6-MBP-EP1融合蛋白在裂解菌液的上清中表达,相对分子质量为65560。结果表明,运用大肠杆菌表达系统成功表达EP1基因融合蛋白,为进一步在体外开展猪EP1基因生物学功能的研究提供基础。
- 杜丽丽李赛赛温丙言王江王月影钟凯
- 关键词：原核表达
