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hFcεRIα/RBL-2H3细胞株的构建与评价被引量：3: 2015年; 目的构建稳定表达人FcεRIα(h FcεRIα)亚基的RBL-2H3细胞株。方法利用RT-PCR技术克隆h FcεRIα基因,构建真核表达载体p CI-neo-h FcεRIα。脂质体介导法转染RBL-2H3细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株。利用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法鉴定转染结果。结果通过对脂质体介导转染体系进行优化,转染效率可高达75.38%。经Western blot、免疫荧光及RT-PCR鉴定,h FcεRIα基因在RBL-2H3细胞内成功表达。结论成功构建h FcεRIα/RBL-2H3细胞模型,为深入研究Ig E与FcεRI作用机制及相关药物开发提供了实验基础。; 王南南刘中成张艳芬刘玉欣崔哲陈瑶; 关键词：IGE RBL-2H3细胞脂质体转染

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的RIP1稳定敲除细胞模型的构建及功能研究被引量：3: 2017年; 目的利用CRISPR/Cas9技术构建RIP1稳定敲除的人永生化表皮细胞HaCaT细胞株,在此基础上对RIP1功能进行探究。方法针对GenBank中RIP1基因序列,设计靶向RIP1不同外显子的小指导RNA(sgRNA),并将其克隆至SpCas9-2A-Puro V2.0(PX459)载体中,获得PX459-sgRNA基因敲除载体。将上述载体转染HaCaT细胞并通过嘌罗霉素筛选获得阳性克隆,免疫印迹和DNA测序技术进一步鉴定RIP1敲除效果最佳的单克隆。通过CCK-8实验检测RIP1缺失对细胞增殖能力的影响。分别用TNF-α处理HaCaT^(WT)细胞和HaCaT^(R1P1KO)细胞,流式细胞仪检测敲除RIP1对TNF-α诱导细胞死亡的影响,进一步通过胱天蛋白酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK判断细胞死亡类型。结果与结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建RIP1完全敲除的细胞模型,功能分析发现敲除RIP1导致细胞增殖能力减慢;HaCaT^(R1P1KO)对TNF-α诱导的死亡畀常敏感,这种死亡能被Z-VAD-FMK显著抑制,证明为caspase依赖性细胞凋亡。该研究为探究RIP1在皮肤损伤中的作用奠定了基础。; 陈瑶刘青邢微微陈惠华张冬冬王园园邹民吉徐东刚刘中成; 关键词：基因敲除 HACAT细胞凋亡细胞增殖

大鼠sFcγRIIb基因原核表达及活性鉴定: 2016年; 旨在克隆大鼠FcγRIIb基因,构建s FcγRIIb原核表达体系,制备重组大鼠s FcγRIIb蛋白。采用RT-PCR技术从RBL-2H3细胞中克隆FcγRIIb胞外区基因,构建重组表达质粒转化大肠杆菌诱导表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,复性后利用Western blotting、ELISA进行鉴定。结果显示,成功克隆大鼠s FcγRIIb基因,构建原核表达载体s FcγRIIb-p ET17b,转化大肠杆菌BL21(DE3)。通过对表达体系进行优化,确定IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为4 h时蛋白表达效率最高,重组蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经8 mol/L尿素溶解,利用Ni-NTA柱亲和层析获得了较高纯度的重组蛋白。采用梯度透析复性法对s FcγRIIb进行复性后,经Western blotting、ELISA与竞争性ELISA鉴定,重组蛋白s FcγRIIb可被特异性抗体所识别且与Ig G具有结合能力。成功建立了大鼠FcγRIIb基因原核表达体系,制备了具有生物学功能的重组蛋白。; 张艳芬刘利鹏陈瑶崔哲毕克维王南南刘中成; 关键词：抑制性受体原核表达重组蛋白

基于胶体金检测核酸适配子与蛋白相互作用的新方法被引量：4: 2015年; 基于核酸适配子对靶蛋白的高特异性及胶体金比色法的高度灵敏性,建立了一种分析核酸适配子与靶蛋白亲和力以及简便快速检测蛋白质的新方法.核酸适配子保护的胶体金在高盐条件下可保持稳定,靶蛋白与胶体金竞争结合适配子,使胶体金发生聚沉,呈现颜色变化,可通过检测A520值分析适配子与靶蛋白的亲和力以及蛋白浓度.通过对适配子浓度、靶蛋白浓度、共孵育时间、竞争反应时间和氯化钠浓度等关键因素进行优化,确定了最佳检测条件.; 刘中成赵丽健刘利鹏张艳芬王南南陈瑶王向欢; 关键词：靶蛋白胶体金

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陈瑶