苏鑫铭
- 作品数：22 被引量：95H指数：5
- 供职机构：南京农业大学动物医学院农业部动物疫病诊断与免疫控制重点开放实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- PrV上海株TK基因缺失株的构建及其生物学特性研究
- 提取伪狂犬病病毒(PrV)SH株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank发表的PrV基因序列(NC006151,BK001744),选择保守序列设计两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)...
- 苏鑫铭于春梅王敏秀曹瑞兵周斌陈溥言
- 关键词：伪狂犬病病毒TK基因生物学特性半数致死量
- 文献传递
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆、测序及高效表达载体的构建
- 本试验构建了猪繁殖与呼吸综合症病毒N基因的原核高效表达载体,为本病新型诊断方法的建立创造了良好的物质条件.
- 王玲许立华王志亮苏鑫铭吴延功王长杰陈溥言
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒核衣壳蛋白基因克隆
- 文献传递
- PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染被引量：30
- 2004年
- 根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)gE、gI基因的序列,设计并合成了一对引物,以PrV容A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法.该方法能从PrV容A株(RA)、上海株(SH)、鲁A株(LA)中扩增出一条848bp的片段,但Bartha-K61株没有扩增出该片段.测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性.对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg.PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现,淋巴结检出率最高,依次为脾、脑(海马角)、肺、肾、肝等.对2003～2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20.34%(35/172),猪场阳性率为40.54%(15/37).实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查.
- 周斌苏鑫铭张素芳贾赟曹瑞兵陈溥言
- 关键词：伪狂犬病毒PCR
- 插入单个loxP位点的伪狂犬病病毒上海株TK基因缺失株的构建被引量：3
- 2006年
- 根据GenBank已发表的pEGFP-C1序列,设计并合成两对引物,PCR扩增出两端各含一loxP位点的GFP表达盒GFP-loxP。克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-GFP-loxP。基于同源重组原理,pSKLR-GFP-loxP与PRVSH株基因组DNA共转染293T细胞,在BrdU的筛选压力下,利用蚀斑法在TK-143细胞上筛选出表达GFP的TK基因缺失的重组毒株rPRV1。将表达Cre酶的质粒载体pPOG231与rPRV1基因组DNA共转染293T细胞,在Cre酶的作用下去除GFP表达盒以及一个loxP位点,筛选得到含单个loxP位点的重组病毒株rPRV2。PCR扩增证实所获得的重组病毒TK缺失270bp,只有一个34bp的loxP位点,并且能在RK-13细胞上稳定传代。LD50试验表明rPrV2的毒力下降。
- 王敏秀苏鑫铭于春梅曹瑞兵陈溥言
- 关键词：TK基因CRELOXP
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和流感病毒HA基因的联合表达及应用被引量：4
- 2003年
- 参照已公布的流感病毒血凝素基因(HA基因)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列,设计并合成一对引物P1、P2,以RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF7片段(约410bp),其中含HA基因主要核苷酸序列(33bp)。用BamH Ⅰ、Xho Ⅰ分别对扩增出的片段及pET32a质粒进行酶切,连接后构建了重组质粒pETHN并转化到BL21(DE3)宿主菌中诱导表达。用纯化后的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的乳胶凝集试验。检测结果显示:该方法有良好的特异性及敏感性,与IDEXX公司FLISA检测试剂盒符合率达93.8％。
- 许立华苏小运王玲苏鑫铭任雪枫苏春霞陈溥言
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒流感病毒HA基因血凝素基因乳胶凝集试验
- PrV上海株TK基因缺失株的构建及其生物学特性研究
- 伪狂犬病病毒(PrV)SH株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank发表的PrV基因序列(NC-006151,BK001744),选择保守序列设计两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的...
- 苏鑫铭于春梅王敏秀曹瑞兵周斌陈溥言
- 关键词：伪狂犬病病毒TK基因生物学特性半数致死量基因序列
- 猪繁殖与呼吸综合征与伪狂犬病混合感染的分子生物学快速诊断被引量：3
- 2003年
- 猪繁殖与呼吸综合征自1987年发现至今,已在世界大多数养猪国家和地区普遍存在[1,2].而伪狂犬病作为仅次于口蹄疫、猪瘟的危害养猪业的重要疫病，一直引起人们的高度重视[3,4].
- 许立华王玲苏鑫铭王志亮吴延功陈溥言
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征伪狂犬病
- 表达Cre重组酶的真核细胞系的建立及在重组伪狂犬病病毒研究中的应用被引量：3
- 2007年
- 根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400μg.mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre。利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达。结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419。将S0419感染已转染pBlulox的293A-Cre细胞,在RK13细胞上筛选得到表达LacZ的重组病毒S06293。S06293在293A-Cre细胞上传代2次,X-Gal原位染色表明LacZ的表达消失。测序结果证实,在Cre重组酶作用下,2个同向loxP序列之间的外源基因序列被正确除去。以上结果表明,本研究构建的稳定表达Cre重组酶的293A-Cre细胞系可以用于在包含有loxP位点的PRV基因组中外源基因的快速删除或整合。
- 苏鑫铭徐亚林于春梅曹瑞兵周斌陈溥言
- 关键词：伪狂犬病病毒PCRCRE重组酶LOXP
- 检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白-ELISA的建立被引量：9
- 2004年
- 将已构建成功的重组质粒pETN转化入E.coliBL21(DE3)中,在最佳诱导条件下获得重组N蛋白。随后用His-Bind对表达产物进行纯化,对纯化效果及纯化产物的特异性分别用SDS-PAGE电泳及Western-blot试验检测。在此基础上,以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包被,作用时间及底物的选择),确定了判定标准,建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法。用此方法检测了200份血清样品,并与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果相比较,符合率达91%。
- 许立华苏鑫铭王玲王志亮吴延功陈溥言
- 关键词：重组质粒重组N蛋白间接ELISA
- 从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因被引量：3
- 2006年
- 根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP。通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109。该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419。荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP。PCR证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去。对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%。以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因。
- 苏鑫铭于春梅王敏秀陈勇军曹瑞兵周斌陈溥言
- 关键词：疱疹病毒科伪狂犬病病毒TK基因CRE重组酶GFP
