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PrV上海株TK基因缺失株的构建及其生物学特性研究: 提取伪狂犬病病毒(PrV)SH株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank发表的PrV基因序列(NC006151,BK001744),选择保守序列设计两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)...; 苏鑫铭于春梅王敏秀曹瑞兵周斌陈溥言; 关键词：伪狂犬病病毒 TK基因生物学特性半数致死量; 文献传递

插入单个loxP位点的伪狂犬病病毒上海株TK基因缺失株的构建被引量：3: 2006年; 根据GenBank已发表的pEGFP-C1序列,设计并合成两对引物,PCR扩增出两端各含一loxP位点的GFP表达盒GFP-loxP。克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-GFP-loxP。基于同源重组原理,pSKLR-GFP-loxP与PRVSH株基因组DNA共转染293T细胞,在BrdU的筛选压力下,利用蚀斑法在TK-143细胞上筛选出表达GFP的TK基因缺失的重组毒株rPRV1。将表达Cre酶的质粒载体pPOG231与rPRV1基因组DNA共转染293T细胞,在Cre酶的作用下去除GFP表达盒以及一个loxP位点,筛选得到含单个loxP位点的重组病毒株rPRV2。PCR扩增证实所获得的重组病毒TK缺失270bp,只有一个34bp的loxP位点,并且能在RK-13细胞上稳定传代。LD50试验表明rPrV2的毒力下降。; 王敏秀苏鑫铭于春梅曹瑞兵陈溥言; 关键词：TK基因 CRE LOXP

PrV上海株TK基因缺失株的构建及其生物学特性研究: 伪狂犬病病毒(PrV)SH株基因组DNA为PCR扩增模板,并根据GenBank发表的PrV基因序列(NC-006151,BK001744),选择保守序列设计两对引物,分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的...; 苏鑫铭于春梅王敏秀曹瑞兵周斌陈溥言; 关键词：伪狂犬病病毒 TK基因生物学特性半数致死量基因序列

表达Cre重组酶的真核细胞系的建立及在重组伪狂犬病病毒研究中的应用被引量：3: 2007年; 根据Cre基因序列设计并合成1对引物,PCR扩增出Cre基因编码区,克隆于pIREShyg载体,得到重组质粒pIREShyg-Cre,转染HEK-293A细胞后经400μg.mL-1 Hygromycin B的筛选,将其中1个阳性克隆命名为293A-Cre。利用伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)S03109株(带有gfp报告基因表达盒及loxP位点)感染293A-Cre细胞,荧光显微镜观察、PCR及Western blot检测gfp基因的表达。结果表明,S03109感染293A-Cre二代后loxP位点间的gfp表达盒被删除,获得重组病毒S0419。将S0419感染已转染pBlulox的293A-Cre细胞,在RK13细胞上筛选得到表达LacZ的重组病毒S06293。S06293在293A-Cre细胞上传代2次,X-Gal原位染色表明LacZ的表达消失。测序结果证实,在Cre重组酶作用下,2个同向loxP序列之间的外源基因序列被正确除去。以上结果表明,本研究构建的稳定表达Cre重组酶的293A-Cre细胞系可以用于在包含有loxP位点的PRV基因组中外源基因的快速删除或整合。; 苏鑫铭徐亚林于春梅曹瑞兵周斌陈溥言; 关键词：伪狂犬病病毒 PCR CRE重组酶 LOXP

伪狂犬病病毒UL24蛋白抗体的制备与细胞内定位研究: 伪狂犬病(Pseudorabies，PR)，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起的一种以多种家畜和野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为主要...; 于春梅; 关键词：伪狂犬病病毒 GFP 细胞内定位; 文献传递

从伪狂犬病病毒中删除Cre/LoxP介导的报告基因被引量：3: 2006年; 根据pEGFP-C1序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出两端各含一个同向LoxP位点的GFP表达盒,克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-G-LoxP。通过经典同源重组方法,得到表达GFP的TK基因缺失伪狂犬病毒重组毒株S03109。该重组病毒在转染了pOG231(表达Cre重组酶)的293T细胞上连续传代,筛选得到重组病毒株S0419。荧光显微镜观察、Western blot及PCR检测结果表明,S03109感染细胞后持续表达GFP,而S0419不表达GFP。PCR证实S0419为含单个LoxP位点的TK基因缺失病毒,并且在细胞培养上遗传稳定,测序结果(GenBank登录号AY822465)表明,在Cre重组酶的作用下,两个同向LoxP序列之间的GFP表达盒被正确除去。对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)及免疫保护实验结果表明,S03109和S0419对BALB/c小鼠的LD50值均大于3×105PFU,免疫BALB/c小鼠,攻毒后平均存活率分别为67.5%与70%。以上结果表明,利用Cre/LoxP位点特异性重组系统,成功去除了插入重组伪狂犬病病毒基因组中的GFP报告基因。; 苏鑫铭于春梅王敏秀陈勇军曹瑞兵周斌陈溥言; 关键词：疱疹病毒科伪狂犬病病毒 TK基因 CRE重组酶 GFP

猪繁殖与呼吸综合症病毒GP5蛋白原核表达初步研究: 2005年; The envelope glycoprotein (GP5) is one of the major structural proteins of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). In this report, the N-terminal hydrophobic sequence of envelope glycoprotein gene (orf5) was deleted by PCR. The gene was subcloned into prokaryotic expressing vector pET-28 a(+) , the recombinant plasmid named pET-GP5 was transformed into E.coli cell BL21. SDS-PAGE and Western-blot indicated that the orf5 gene was expressed successfully and the recombinant fusion protein, which was about 20.8kDa, had immunologically reactive activity. The studies lay foundations for further study on the development of vaccines for PRRSV.; 陈勇军苏鑫铭高晓飞郑其升于春梅曹瑞兵周斌陈溥言; 关键词：猪繁殖与呼吸综合症病毒 GP5蛋白原核表达

伪狂犬病病毒UL24基因的原核表达及抗UL24蛋白抗体的制备被引量：3: 2007年; 为了给伪狂犬病病毒(PrV)UL24蛋白的细胞定位和功能研究提供参考依据,据GenBank公布的PrVUL24基因序列(登录号NC006151)设计1对引物,以质粒pUL24-GFP为模板,用PCR方法扩增出部分缺失的基因片段mUL24(modified UL24)。将mUL24片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达载体pET-UL24。阳性质粒转化宿主菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白(His)6-UL24以包涵体的形式获得表达。用纯化后的pET-UL24融合蛋白免疫家兔,ELISA分析表明,在血清效价达到1∶2 560以上,Western-blot分析制备的抗体可以和pET-UL24表达产物发生反应,具有良好的免疫特异性。; 于春梅李鹏郑其升李斐苏鑫铭曹瑞兵周斌陈溥言; 关键词：伪狂犬病毒原核表达抗体制备

伪狂犬病病毒ul24基因表达蛋白的胞内定位研究被引量：2: 2006年; 根据GenBank已发表的PrVul24基因序列(NC006151),设计并合成一对引物,PCR扩增出ul24基因编码区,克隆于pEGFP-N1载体,得到重组质粒pUL24-GFP。酶切鉴定,测序及WesternBlot验证重组质粒。ul24基因序列测定结果已提交GenBank,登录号DQ226544。Westernblot分析结果表明UL24-GFP融合蛋白为45KD。将pUL24-GFP转染真核细胞,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞内定位,结果表明UL24-GFP融合蛋白定位于细胞核。; 苏鑫铭徐亚林于春梅曹瑞兵周斌陈溥言; 关键词：伪狂犬病病毒 PCR GFP

猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备被引量：2: 2008年; 根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,构建原核表达载体pET-ORF6。阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSVORF6基因获得表达。以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体。经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应。兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础。; 郑其升杨瑞锋毕志香李鹏于春梅曹瑞兵陈溥言; 关键词：ORF6基因抗体制备

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于春梅

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