杨松涛
- 作品数：329 被引量：729H指数：11
- 供职机构：军事医学科学院更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划公益性行业(农业)科研专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- 鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒的构建及鉴定被引量：1
- 2017年
- 目的构建鼠源Bif-1(Bax-interacting factor-1)蛋白7种选择性剪接异构体(alternatively spliced isoforms)真核表达质粒,并在BHK和N2a细胞中表达。方法以提取的N2a细胞总RNA为模板,采用RT-PCR、重叠延伸PCR等方法扩增目的基因Bif-1(transcript variant 1、transcript variant 2、transcript variant 3、transcript variant x1、transcript variant x2、transcript variant x3、e),并将目的基因连入真核表达载体p IRES2-EGFP,构建重组质粒。重组质粒经鉴定正确后经脂质体介导转染BHK和N2a细胞,采用荧光显微镜观察及Western blot法检测转染细胞中Bif-1蛋白的表达。结果琼脂糖凝胶电泳可见与预期大小相符的核酸条带;重组质粒经PCR、双酶切、测序鉴定证明构建正确;重组质粒转染BHK或N2a细胞后荧光显微镜下可见绿色荧光;Westen blot可检出相应大小的目的条带。结论成功构建了鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒,并在BHK和N2a细胞中获得表达。为进一步探索Bif-1蛋白不同选择性剪接异构体的生物学功能,研究其在细胞自噬、细胞凋亡以及抗肿瘤等方面的作用奠定了基础。
- 侯朋飞金宏丽金宏丽曹增国李岭曹增国吴芳芳闫飞虎李国华赵永坤高玉伟王化磊
- 关键词：真核细胞基因表达
- 犬细小病毒NJ-04株VP2的基因克隆及序列分析
- 从我国南京地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离出一株细小病毒(CPV)。以煮沸的病毒细胞培养物模板,特异引物进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体并转化E.coli JM109。重组质粒pTCPV-VP2经...
- 刘清津叶俊华杨松涛夏咸柱谌南辉
- 关键词：犬细小病毒VP2基因
- 文献传递
- SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E.coli中的高效表达被引量：1
- 2005年
- 对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,对SARS病毒N蛋白基因进行了RT-PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-N,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp,编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100%。将pGEM-N双酶切,回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,构建了重组质粒pET-N;将其转化表达菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明:重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Western-blotting证实,重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43%。
- 杨松涛夏咸柱乔军高玉伟常爽黄耕郑明光
- 关键词：SARS病毒N蛋白基因克隆
- 犬冠状病毒基因疫苗表达载体的构建及其免疫原性研究被引量：2
- 2006年
- 以pVAX1为载体首次构建了犬冠状病毒病基因的3种真核表达质粒。首先将犬冠状病毒大熊猫株(CCV DXMV)纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。将测序后的质粒pTS、pTM和pTN分别双酶切,回收目的基因片段并将其定向克隆到真核表达质粒pVAX1中得到重组质粒pVAXS、pVAXM和pVAXN。将这3种真核表达质粒通过脂质体介导法转染MDCK细胞,通过RT-PCR法进行转录水平的检测,并用间接ELISA法检测目的蛋白的表达情况。结果在pVAXS、pVAXM、pVAXN转染MDCK细胞36 h后就可检测到目的基因的转录;在转染72 h后可检测到3种目的蛋白的表达。动物免疫试验表明,3种真核表达载体能有效地诱导机体产生细胞免疫与体液免疫应答,这为CCV基因疫苗的研究奠定了良好的基础。
- 乔军夏咸柱杨松涛郝峰高玉伟郑晓一黄耕
- 关键词：犬冠状病毒免疫原性
- 金刚烷胺修饰物对禽流感(H_5N_1)病毒的抑制作用被引量：6
- 2007年
- 目的:寻找高效低毒的抗禽流感病毒药物。方法:体外实验选用狗肾细胞(MDCK),实验分为正常对照组、病毒对照组和受试化合物组,采用细胞病变法结合MTT法检测金刚烷胺修饰物(NAM)对MDCK细胞的半数中毒浓度、对禽流感病毒的半数抑制浓度和治疗指数;体内实验采用NAM对禽流感病毒H5N1亚型小鼠感染模型的治疗实验,检测小鼠的死亡率、存活率、死亡保护率和延长生命率。结果:体外实验,NAM对MDCK细胞的最大无毒浓度为235.09mg.L-1,半数致死浓度为1582.78mg.L-1,NAM对禽流感病毒半数抑制浓度(IC50)为15.32mg.L-1,治疗指数(TI,103.31)高于金刚烷胺对照组(TI,48.48);体内实验,NAM100mg.kg-1剂量组对H5N1感染小鼠的死亡率(12.5%)明显低于病毒对照组小鼠死亡率(87.5%)(P<0.05),平均生存日数(13.38d)明显高于病毒对照组平均生存日数(9.63d)(P<0.05),肺炎抑制率(99.15%)和生命延长率(26.79%)均高于金刚烷胺对照组肺炎抑制率(69.18%)和生命延长率(13.39%)(P<0.05)。结论:NAM体外毒性和抗病毒活性均优于阳性对照金刚烷胺;体内抗病毒活性较好,可显著降低禽流感病毒感染小鼠的死亡率、提高平均生存日数和延长生命率。
- 徐坤侯雷杨松涛王宏芳吴新宇张秀芝李娟李静夏咸柱
- 关键词：禽流感病毒金刚烷胺抗病毒活性
- AIV高免血清对H5N1亚型高致病性禽流感的紧急预防效果研究
- 应用马抗流感病毒高免血清,以不同剂量(0.2mL,0.1mL,0.05mL)和不同时间(攻毒前8天、4天、1天)给小鼠进行腹腔注射,探讨其对抗高致病性禽流感病毒感染的紧急预防效果.结果表明:在以30个LD50病毒对小鼠进...
- 王承宇王化磊杨松涛高玉伟冯娜王铁成邹啸环王定坤夏咸柱
- 关键词：致病性禽流感高免血清H5N1亚型
- 文献传递
- 裂谷热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：3
- 2014年
- 目的建立一种快速、敏感、特异的Real-time PCR(实时荧光定量PCR)方法,用于裂谷热病毒(RVFV)的检测。方法根据裂谷热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-time PCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0.99,灵敏度为1.0×101拷贝,高于常规PCR方法(1.0×103拷贝);除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批间重复的变异系数均小于1%。结论建立的裂谷热病毒Real-time PCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷热病毒感染快速诊断及流行病学调查。
- 盖微微迟航迟航薛向红郑学星王化磊薛向红赵永坤高玉伟黄耕王化磊夏咸柱
- 关键词：PCRTAQMAN探针
- 犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定被引量：7
- 2014年
- 用纯化后的犬瘟热病毒免疫Balb/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株,并挑选阳性孔进行亚克隆,用Vero细胞交叉反应试验及间接免疫荧光检测单克隆抗体的特异性。结果获得2株能稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体细胞株,分别命名为062-1、062-2。实验室已有的一株单克隆抗体为6H8。交叉反应试验及间接免疫荧光染色检测表明,3株单克隆抗体的特异性较好;经过体外连续传代及反复冻存、复苏,杂交瘤细胞均能稳定分泌特异性单克隆抗体。培养上清液及小鼠腹水间接ELISA效价分别为1∶105和1∶108。相加试验表明,单克隆抗体062-1、062-2具有共同的表位,而单克隆抗体6H8识别的位点与其他两株不同。
- 王铮王铁成冯娜虞一聪高玉伟杨松涛夏咸柱
- 关键词：犬瘟热病毒单克隆抗体间接酶联免疫吸附试验
- MALDI质谱成像技术在狂犬病病毒小鼠组织内定位研究中的应用被引量：1
- 2012年
- 目的:建立基于MALDI质谱的狂犬病病毒小鼠脑组织内质谱成像实验方法,寻找狂犬病病毒脑组织内定位标记物。方法:制备冰冻切片,进行组织上原位酶解及基质覆盖,利用MALDI质谱扫描成像,以及FlexImaging 2.1软件分析,对差异肽段进行二级质谱鉴定。结果:初步鉴定出了四段狂犬病病毒肽段,可作为组织内狂犬病病毒定位标志物。结论:为进一步提高狂犬病病毒组织内定位的精确度奠定了研究基础。
- 徐静杨松涛万家余张守峰许娜李楠许琴刘文森
- 关键词：MALDI狂犬病病毒分子成像
- 狂犬病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)减毒活疫苗候选株的构建与筛选
- 本发明涉及一种狂犬病毒减毒疫苗突变株，其中狂犬病毒的糖蛋白的333位点由精氨酸突变为谷氨酸。本发明还涉及该狂犬病毒减毒疫苗突变株的制备方法和应用。
- 步志高夏咸柱葛金英王喜军杨松涛冯娜
