郭敏
- 作品数：15 被引量：77H指数：5
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金：湖北省教育厅重点项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 大鼠结缔组织生长因子短发夹RNA干扰质粒重组体的构建和鉴定被引量：9
- 2007年
- 目的构建靶向大鼠结缔组织生长因子(CTGF)的shRNA真核表达载体质粒,为利用基因沉默技术从转录后水平进行抗心肌纤维化的研究做准备。方法根据大鼠CTGFmRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同。结论成功构建靶向大鼠CTGF的shRNA真核表达质粒重组体,为质粒的筛选和进一步进行体内外心肌纤维化的RNA干扰研究奠定了基础。
- 郎明健曾秋棠郭敏杨汉东闵新文
- 关键词：结缔组织生长因子RNA干扰心肌纤维化质粒
- 大鼠Cx43基因慢病毒表达载体的构建及转染骨髓间充质干细胞表达的观察被引量：3
- 2010年
- 目的:构建大鼠缝隙连接蛋白43(Cx43)基因的重组慢病毒表达载体,并转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC),观察Cx43的表达。方法:采用RT-PCR技术获得大鼠Cx43基因,并将其连接到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pGC-FU中,重组获得慢病毒质粒pGC-FU-Cx43,将其与辅助包装质粒(pHelper1.0、pHelper2.0)一起共转染293T细胞,包装生产病毒并测定滴度。所获慢病毒感染大鼠BMSC后,采用荧光显微镜和Western blot方法检测Cx43的表达。结果:酶切证实Cx43基因已定向连入目的载体,测序结果显示,所构建的pGC-FU-Cx43重组慢病毒质粒序列与目标序列完全一致。获得的病毒滴度为2×109TU/ml。经分离、纯化得到BMSC;pGC-FU-Cx43转染BMSC后,可见大量EGFP表达,Cx43的表达量明显增加。结论:成功构建并包装获得较高滴度的重组慢病毒pGC-FU-Cx43。pGC-FU-Cx43可高效转染BMSC,Cx43表达增加,且实现稳定转染。
- 李松南毛晓波冯义柏王祥曾秋棠毛奕吉庆伟彭昱东郭敏梁志山
- 关键词：缝隙连接蛋白43慢病毒
- 原发性高血压早期肾损害患者血清效应性T淋巴细胞亚群特征因子的变化被引量：7
- 2009年
- 目的:探讨血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-4及IL-17水平与原发性高血压患者早期肾损害的关系。方法:68例原发性高血压患者依据尿白蛋白排泄率检测结果分为早期肾损害组和无肾损害组,健康体检者24例作为对照组。采用放射免疫法检测血浆ATⅡ水平,ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-4和IL-17水平。结果:早期肾损害组ATⅡ、IFN-γ和IL-17水平增高,与无肾损害组和对照组相比差异有统计学意义;3组IL-4水平变化小,差异无统计学意义;ATⅡ水平与IFN-γ、IL-17水平呈正相关,而与IL-4水平无相关性。结论:原发性高血压患者的高ATⅡ水平使效应性T淋巴细胞亚群活性发生变化,导致Th1、Th17的功能上调与早期肾损害的发生和发展。
- 郭景枝张嫩英刘鸿涛郭敏彭昱东李松南吉庆伟曾秋棠
- 关键词：原发性高血压早期肾损害干扰素Γ白细胞介素-4白细胞介素-17
- RNA干扰选择性下调心肌成纤维细胞结缔组织生长因子被引量：1
- 2008年
- 目的研究RNA干扰技术能否选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)及其诱导的下游纤维化成分的表达。方法利用差速贴壁法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞。用携带U6启动子和CTGF特异性短发夹RNA(shRNA)编码序列的质粒载体CTGF-shRNA,及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒CTGF-con以lipofectamine ^(TM)2000为载体转染原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞。加入含G418的DMEM培养液培养一月筛选后获得稳定转染的细胞。通过半定量RT-PCR检测细胞内转化生长因子(TGF-β_1),CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达,Western-blot法检测细胞内CTGF及其下游纤维化成分纤维连接蛋白(FN)的表达。结果CTGF在心肌成纤维细胞中有基础表达,并在转化生长因子β_1(TGF-β_1)刺激下其含量增加,CTGF-shRNA使心肌成纤维细胞CTGF的mRNA和蛋白质的表达分别降低65%和78%,FN的mRNA和蛋白质的表达分别降低81%和63%,而TGF-β_1 mRNA的表达上调32%。转染对照质粒组较空白对照组与脂质体组CTGF,FN表达量差异无统计学意义。结论RNA干扰技术能选择性下调乳鼠心肌成纤维细胞CTGF及下游纤维化成分FN的表达,进一步为拮抗心肌纤维化的基因治疗提供了依据。
- 郭敏郎明健曾秋棠杨汉东闵新文
- 关键词：RNA干扰结缔组织生长因子转染心肌成纤维细胞心肌纤维化
- 粒细胞集落刺激因子对大鼠心肌梗死后血管再生及心功能的影响被引量：1
- 2010年
- 目的探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对大鼠心肌梗死后血管再生及心功能的影响。方法实验组:为G-CSF注射组,于结扎大鼠左前降支动脉前24h及术后6天给予G-CSF 10μg/(kg.d)皮下注射;对照组:为生理盐水注射组,皮下注射同等剂量的生理盐水。体外分离培养大鼠EPCs,免疫荧光法检测其FITC-UEA-1及Dil-acLDL的表达。心梗后4周,心脏超声检查心功能,处死大鼠,留取心脏标本作HE病理染色,并对梗死区心肌组织进行毛细血管密度测定。另设假手术组10只为正常对照。结果培养获得EPCs,其表型为Dil-acLDL+、FITC-UEA-1+,实验组EPCs密度明显高于对照组。心梗后4周,实验组大鼠左心室射血分数及左心室短轴缩短率较对照组明显提高。实验组梗死心肌处血管密度较对照组明显增高。结论①用密度梯度离心法从大鼠外周血MNC中可成功地培养出EPCs,G-CSF可促进EPCs的动员。②G-CSF能促进梗死后心肌血管新生,改善心功能。
- 杨亚荣闵新文郎明健郭敏张静
- 关键词：心肌梗死内皮祖细胞粒细胞集落刺激因子心功能
- RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子拮抗肾脏纤维化的发展被引量：5
- 2010年
- 目的 研究RNA干扰靶向抑制结缔组织生长因子（CTGF）对高血压大鼠肾脏纤维化指标的影响.方法 本研究于2006-2008年在武汉协和医院心血管病研究所完成,实验以自发性高血压大鼠（SHR）为动物模型,随机（随机数字法）分为未干预的SHR组（n=10）和RNA干扰组（RNAi组,n=10）,并设置WKY大鼠（n=8）为正常对照组.构建并筛选出靶向大鼠CTGF的RNAi质粒重组体,通过升主动脉钳夹冠脉灌注法联合尾静脉注射将质粒转染至大鼠体内,RNA干扰结束后,获取肾脏标本,RT-PCR和Western blotting检测肾脏组织CTGF及纤维连接蛋白（FN）的mRNA和蛋白表达,免疫组化技术分析CTGF及FN在肾脏的空间表达.0.1%天狼星红-饱和苦味酸胶原染色分析肾组织胶原类型及代谢水平（以胶原容积分数CVF表示）,比色法测定肾脏组织羟脯氨酸含量.所有数据以（x-±s）表示,多个均数的组间比较采用单因素方差分析,以P〈0.05为有统计学意义.结果 RNA干扰使高血压大鼠肾脏组织CTGF的mRNA和蛋白表达分别下调66%和62%（P〈0.01）,FN mRNA和蛋白的表达也相应降低达56%和51%（P〈0.01）;免疫组化显示了同样的抑制效应,而且观察到CTGF及FN不同的空间表达,CTGF在肾实质和间质中均可表达,而FN主要在肾脏间质表达.天狼星红染色显示RNA干扰组胶原沉积减少,偏光显微镜下进一步观察到RNA 干扰主要抑制了I型胶原的合成;肾脏组织羟脯氨酸含量在RNA干扰组显著减少[SHR组：（0.596±0.067）μg/mg,RNAi组：（0.368±0.084）μg/mg,P〈0.01].结论 C-CTGF靶向性RNA干扰显著下调肾组织中CTGF的表达并相应抑制细胞外基质在肾间质的沉积,且这种效应独立于降压之外.提示CTGF在肾脏纤维化发生及进展中起着关键作用.
- 郎明健闵新文李健郭敏杨汉东
- 关键词：结缔组织生长因子肾脏纤维化RNA干扰纤维连接蛋白
- 内皮祖细胞移植对大鼠心肌梗死后缺血心肌血管再生及心功能的影响被引量：18
- 2008年
- 背景:内皮祖细胞是一类能直接分化为血管内皮的前体细胞,不仅参与胚胎期血管发育,也在成体血管新生中起重要作用。目的:观察内皮祖细胞移植对心肌梗死大鼠心肌血管再生及心功能的影响。设计、时间及地点:随机对照,在体组织病理学观察,于2006-07/2007-07在华中科技大学同济医学院附属协和医院心研所完成。材料:清洁级Wistar雄性大鼠80只,65只大鼠建立心肌梗死模型,剩余15只作为假手术组,不结扎冠状动脉。细胞标记BrdU及其抗体为Sigma公司产品,EBM-2细胞培养液基质为Gibico公司产品。方法:抽取大鼠外周血,通过密度梯度离心获得单个核细胞,贴壁法分离培养内皮祖细胞,加入BrdU至终浓度为100mg/L予以标记,继续培养7d移植备用。造模成功大鼠随机分为2组:内皮祖细胞移植组30只,将BrdU标记的内皮祖细胞悬液100μL分5点注射到左室前壁梗死灶边缘;培养基对照组30只,以同样方式注射等量的EBM-2细胞培养液基质。主要观察指标:移植后4周对梗死区心肌组织进行病理学及免疫组化检测,测定新生毛细血管密度。心脏超声检查心功能变化。结果:造模过程5只大鼠死亡。内皮祖细胞移植组在心肌瘢痕区边缘发现植入的内皮祖细胞、新生毛细血管和少许淋巴细胞,且存在棕褐色的BrdU阳性细胞;培养基对照组在移植区仅见少许淋巴细胞,无内皮祖细胞成分及BrdU阳性细胞。内皮祖细胞移植组梗死心肌瘢痕边缘毛细血管密度明显高于培养基对照组(P<0.01)。与假手术组比较,内皮祖细胞移植组和培养基对照组的各项心功能指标均出现明显变化,差异有显著性意义(P<0.05)。内皮祖细胞移植组的左室射血分数、缩短率均较培养基对照组明显提高(P<0.01)。结论:同种异体内皮祖细胞移植到心肌梗死大鼠缺血心肌后能分化为毛细血管内皮细胞,促进梗死后心肌血管新生,改善心功能。
- 杨亚荣曾秋棠郎明健闵新文郭敏彭昱东吉庆伟张静
- 关键词：内皮祖细胞细胞移植心肌梗死心功能
- 大鼠心肌细胞结缔组织生长因子的诱导表达及RNA干扰研究被引量：1
- 2009年
- 目的:探讨心肌细胞对结缔组织生长因子(CTGF)的基础表达及转化生长因子β1(TGF-β1)对其分泌的诱导作用,并进一步研究以RNA干扰(RNAi)技术靶向抑制CTGF对下游纤维化因子的影响。方法:实验分为以下5组:组Ⅰ:单纯心肌细胞组;组Ⅱ:TGF-β1诱导组;组Ⅲ:阴性质粒组;组Ⅳ:RNAi组;组Ⅴ:脂质体组。分离培养Sprague Dawley(SD)大鼠乳鼠心肌细胞,以5μg/L终浓度的TGF-β1对培养的心肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠CTGF的短发夹RNA(shRNA)干扰质粒转染入心肌细胞,流式细胞技术分选出成功转染的细胞。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western blotting)技术进一步研究各实验组心肌细胞CTGF、纤维连接蛋白(FN)mRNA及蛋白的表达水平。结果:单纯心肌细胞组对CTGF、FN均有低水平的基础分泌,在予以TGF-β1诱导后表达水平显著升高(P<0.01);而在靶向特异性RNAi后,上述因子的表达均被显著抑制(P<0.01);并且纤维化因子FN的表达水平与促纤维化因子CTGF的表达显著相关。结论:心肌细胞可自主低水平分泌或诱导后高表达CTGF及下游纤维化因子FN,提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化及心脏重塑过程;而通过RNAi靶向抑制CTGF后可阻抑心肌细胞分泌下游纤维化因子,进一步提示CTGF是促心肌纤维化的关键性细胞因子,而RNAi是一种特异高效的很有前途的干预手段。
- 郎明健杨汉东闵新文曾秋棠郭敏李健
- 关键词：心肌细胞结缔组织生长因子RNA干扰心肌纤维化
- 心肌细胞结缔组织生长因子的表达及TGF-β1对其表达的影响被引量：10
- 2008年
- 目的:研究纯化的心肌细胞中结缔组织生长因子(CTGF)基因及蛋白的表达,并探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对其表达的影响。方法:分离培养乳鼠心肌细胞,48h后用流式分选方法(FACS)分选纯化心肌细胞,纯化的心肌细胞继续培养48h。分为对照组(空白纯化心肌细胞组)和TGF-β1刺激组,用RT-PCR方法测定两组细胞中TGF-β1、CTGF、纤维连接蛋白(FN)mRNA的含量,用Western blotting法检测两组细胞胞浆蛋白中CTGF、FN含量。结果:心肌细胞中有较低水平的CTGF表达,在予以TGF-β1刺激后细胞内CTGFmRNA与蛋白含量分别提高2.49倍(P<0.01)和3.63倍(P<0.01),FN mRNA与蛋白含量分别提高1倍(P<0.01)和4.18倍(P<0.01),而TGF-β1mRNA水平减少34%(P<0.01)。结论:纯化的心肌细胞有CTGF的基础表达,并且TGF-β1可以明显上调其表达,提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化过程。
- 郭敏郎明健曾秋棠杨汉东闵新文
- 关键词：心肌细胞心肌纤维化结缔组织生长因子转化生长因子Β
- 靶向大鼠CTGF的shRNA表达载体的构建和作用分析被引量：5
- 2008年
- 目的:构建并筛选靶向大鼠结缔组织生长因子(CTGF)的shRNA表达载体.方法:根据大鼠CTGF mRNA序列设计并构建4个靶向大鼠CTGF基因的shRNA干扰质粒;然后以脂质体转染试剂将目的质粒转染至大鼠心肌成纤维细胞,流式细胞技术分选出成功转染的阳性细胞.通过RT-PCR和Western Blot技术对成功构建的4个shRNA干扰质粒进行有效性筛选,分析其CTGF mRNA及蛋白表达水平.结果:酶切证实转录shRNA的目的基因片段已成功克隆入载体,经测序证明与设计的相同;在转染成纤维细胞48h后,与空白对照组比较,有3组细胞CTGF mRNA及蛋白表达水平明显降低;而转染非特异阴性质粒对照组CTGF mRNA及蛋白表达水平无明显变化.结论:成功构建并筛选出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表达质粒重组体,为进一步进行体内外心肌纤维化的RNA干扰研究奠定了基础.
- 郎明健曾秋棠郭敏杨汉东闵新文
- 关键词：结缔组织生长因子RNA干扰心内膜心肌纤维化
