李家大 作品数:34 被引量:57 H指数:5 供职机构: 中南大学 更多>> 发文基金: 国家自然科学基金 新疆维吾尔自治区自然科学基金 河南省基础与前沿技术研究计划项目 更多>> 相关领域: 医药卫生 生物学 文化科学 农业科学 更多>>
Waardenburg综合征致病基因SOX10重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义 被引量:4 2015年 目的通过构建基因SOX10及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达,为研究Waardenburg综合征(Waardenburgsyndrome,WS)发病机制提供实验基础。方法通过分子克隆技术双酶切pECE-SOX10和pCMV—Flag后连接构建SOX10基因重组真核细胞表达质粒pCMV-SOX10-Flag,以其为模板分别构建SOX10基因新发突变G37fs、G38fs和E248fs表达质粒,DNA测序鉴定。SOX10、G37fs、G38fs和E248fs表达质粒分别瞬时转染NIH3T3细胞,Western印迹和细胞免疫荧光分别检测和观察野生和突变SOX10蛋白在NIH3T3细胞中的外源性表达和定位表达。结果SOX10及其突变体G37fs、G38fs和E248fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确,三者在NIH3T3细胞中正确表达,E248fs与SOX10仅在细胞核中分布,G37fs和G38fs在细胞质与细胞核中均有分布。结论成功构建了SOX10基因及其突变体真核细胞表达质粒,突变对SOX10蛋白的亚细胞定位产生影响,为在体外实验进一步研究中国人SOX10基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础。 张华 冯娟 陈红胜 李家大 罗浑金 冯永关键词:基因突变 体外实验 低促性腺激素性性腺功能减退症患者PROKR2基因突变分析 被引量:1 2022年 为探讨特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(IHH)患者的临床及遗传学特征, 回顾性分析23例IHH患者的临床资料, 应用全外显子测序(WES)结合Sanger方法进行基因分析, SIFT和Polyphen 2种生物信息学平台对突变位点进行功能预测。结果显示, 在23例IHH患者中, 9例患者存在前激动素2(PROKR2)基因突变, 其中4种错义突变(p.W178S、p.Y113H、p.A103V、p.R164Q), 1种移码突变(p.D42delinsDED), 功能预测显示以上突变可能是该病的致病基因, 余14例阴性。IHH患者无论PROKR2基因突变有无, 其卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮、雌二醇水平差异均无统计学意义。PROKR2基因突变与IHH疾病可能相关, 其突变丰富基因致病谱。 解一丹 郑瑞芝 韩宾宾 袁慧娟 李家大关键词:性腺功能减退症 突变 利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白 被引量:1 2018年 目的:利用酵母双杂交技术从人c DNA文库中筛选人前动力蛋白受体2(hPROKR2)C端相互作用蛋白。方法:复苏酵母菌Y2HGold-hPROKR2-C,与人c DNA文库杂交,计算杂交效率;筛选相互作用克隆并测序,寻找hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白;通过在DDO/X、QDO/A/X平皿上划线,对筛选到的人c DNA文库质粒的自活性进行验证;采用GST pull down进一步验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交实验的杂交融合效率为1.375×10~8;在人cDNA文库中筛选出hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白SNAPIN,GST pull down实验证实两者之间存在相互作用。结论:SNAPIN可与hPROKR2蛋白C端结合。 周晓涛 周文涛 夏开德 刘化蝶 彭震 赵云娟 迪丽娜尔.波拉提 李家大关键词:相互作用蛋白 酵母双杂交 酵母表达质粒pGBKT7-hPROKR2-Ct的构建及hPROKR2C端蛋白的自激活鉴定 2016年 目的:检测Y2HGold酵母株中表达的h PROKR2 C端蛋白是否有毒性及自激活,为后期利用酵母双杂交技术研究h PROKR2 C端相互作用蛋白奠定基础。方法:构建酵母双杂交载体p GBKT7-h PROKR2-Ct质粒,将其转入酵母感受态中验证其是否表达并计算转化率;通过观察SD/-Trp平板上酵母菌落生长状态进行h PROKR2 C端蛋白的毒性检测;通过观察SD/-Trp、SDO/-Trp/X、SDO/-Trp/X/Aba平板上酵母菌落生长状态进行h PROKR2 C端蛋白自活性检测。结果:构建了酵母双杂交载体p GBKT7-h PROKR2-Ct,将其转入酵母感受态中,转化率为8.5×104cfu/μg;毒性及自活性检测均显示h PROKR2 C端蛋白对酵母菌株无毒性、不具有自活性。结论:可以利用酵母双杂交系统研究hPROKR2 C端相互作用蛋白。 周晓涛 夏开德 周文涛 刘化蝶 彭震 汤勇 李家大关键词:酵母双杂交 拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达 被引量:1 2000年 将拟南芥 ATL P- 3基因从质粒 p UCTL 亚克隆到植物表达载体 p BI12 1中 ,得到的质粒命名为p BITL。被亚克隆到重组质粒 p BITL 的 ATL P- 3基因通过农杆菌 L BA44 0 4介导法导入烟草 (N icotiana tobacco L.var Gexin No.1)。通过卡那霉素抗性筛选 ,得到 19株再生烟草植株。PCR(用根据 ATL P- 3基因合成的引物 )检测到其中 4株 (A1、A4、B2、C6 )有 ATL P- 3基因的整合。进一步的 PCR(用根据 Ca MV35 s启动子和 NOS终止子序列合成的引物 )分析表明 ,ATL P- 3基因是在 Ca MV35 s启动子和 NOS终止子控制下整合到烟草的基因组 DNA中的。 4株转基因烟草的 Southern blotting检测结果显示 ,只有被整合到 B2和 C6的 ATL P- 3基因稳定地存在于基因组 DNA中 ;Western blotting检测分析表明 ,仅有 C6转基因植株表达了 ATL P- 黄虎 耿川东 李家大 郝建疆 谢伟军 龚蓁蓁关键词:转基因烟草 拟糖多肽及其应用 被引量:6 2000年 李家大 王克夷关键词:噬菌体展示 疫苗 中国先天性低促性腺激素性性腺功能减退症患者ANOS1的突变 被引量:1 2022年 目的:先天性低促性腺激素性性腺功能减退症(congenital hypogonadotropic hypogonadism,CHH)是一种罕见的先天性疾病,由于下丘脑促性腺激素释放激素的合成、分泌或信号转导缺陷引起先天性性腺发育不良。CHH以青春期发育延迟或缺乏、性激素及促性腺激素水平低下为主要表现,同时可能伴有其他临床表型。一部分CHH患者伴有嗅觉丧失或低下,被称为卡尔曼综合征(Kallmann syndrome,KS)。ANOS1基因是第一个被发现的CHH致病基因,位于X染色体上,其突变可导致X-连锁隐性遗传的CHH。本研究拟通过分析CHH患者中ANOS1的基因突变图谱以及临床表型和基因型的关系,为CHH的遗传学诊断奠定基础。方法:利用全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)的方法筛选来自中国的165名男性CHH患者中ANOS1基因的罕见变异(rare sequencing variants,RSVs)。利用Polyphen2、Mutation tastaster、SIFT和CADD(Combined Annotation Dependent Depletion)4种常见的生物信息学工具预测编码区变异的功能,基于神经网络的剪接位点预测(Splice Site Prediction by Neural Network,NNSPLICE)软件对检测到的内含子区的RSVs进行注释,并利用美国医学遗传学和基因组学学院(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)遗传变异分类标准与指南判断ANOS1 RSVs是否具有致病性。初步建立中国人群CHH患者ANOS1的遗传突变谱,通过收集部分患者详细的临床资料,建立临床表型和基因型的相关性。结果:WES分析显示165名CHH患者中17例患者发生了ANOS1突变,突变频率为10.3%。在17名CHH患者中共检测到13个ANOS1 RSVs,包括5个无义突变(p.T76X、p.R191X、p.W257X、p.R262X和p.W589X),2个剪切位点突变(c.318+3A>C和c.1063-1G>C)和6个错义突变(p.N402S、p.N155D、p.P504L、p.C157R、p.Q635P及p.V560I)。在17名携带ANOS1 RSVs的患者中,很多同时伴有其他临床表型,其中最常见的为隐睾(10/17),其次是单侧肾脏发育不全(3/17),牙齿� 曾旺 李家大 李家大 姜芳 门美超关键词:隐睾 研究生“医学科研设计”慕课建设与应用探讨 被引量:1 2022年 “医学科研设计”作为方法类课程是医学研究生重要的专业基础课。文章在简述医学科研设计教学目标的基础上,围绕医学科研设计慕课教学团队的建设、教学短视频资源和非视频资源建设、教学活动的组织与成绩评定分享“医学科研设计”的课程建设经验,并进一步结合“医学科研设计”慕课的应用从有利于满足不同学习者个性化学习需求、有利于促进研究生教育的课堂教学改革及有利于构建“互联网+”课程思政模式提出思考和建议。 罗自强 冯丹丹 秦晓群 黄菊芳 胡长平 李家大 熊鲲 何海伦 黎明 李芳 曾小敏 史静琤 程岩关键词:研究生教育 医学科研设计 应用CRISPR-cas9技术敲除PAH基因建立小鼠自闭症模型 目的:利用CRISPR-cas9 技术敲除小鼠PAH 基因,建立小鼠自闭症的动物模型。方法:设计PAH 基因的sgRNA,构建PUC57-sgRNA 载体,在体外将sgRNA 以及Cas9 的载体转录为RNA,通过显微注... 曹贝贝 李登峰 黄婷 李家大关键词:PAH基因 自闭症 MITF基因突变致Ⅱ型Waardenburg综合征发病的实验研究 被引量:1 2014年 目的通过体外实验研究小眼球畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)突变基因功能,初步探讨其致Ⅱ型Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome,WS)发病的分子机制。方法以野生型MITF基因真核细胞表达质粒pCMV-MITF-Flag为模板分别构建二个致Ⅱ型WS的MITF基因新发突变R217I和T192fsX18的真核细胞表达质粒。野生MITF和突变R217I和T192fsX18表达质粒瞬时转染黑色素瘤细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞),应用Western blot和细胞免疫荧光分别检测其表达和亚细胞定位;应用荧光素酶活性检测系统通过对酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)报告基因活性检测观察野生/突变MITF蛋白对其靶基因TYR转录活性的调控作用,以及二个突变蛋白对野生MITF蛋白功能的影响;应用生物素标记的含E box基序(CATGTG)的DNA寡核苷酸链探针分别沉淀MITF、R217I及T192fsX18蛋白,检测野生/突变MITF蛋白与靶基因TYR启动子的结合力。结果成功构建了突变型R217I、T192fsX18真核细胞重组表达质粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fsX18-Flag,MITF蛋白与R217I、T192fsX18突变蛋白在黑色素瘤细胞中正确表达,进一步验证了重组质粒构建的正确性。突变R217I蛋白与野生MITF蛋白一样仅在细胞核中分布,而T192fsX18蛋白则出现异常亚细胞定位,仅在细胞质中分布。尽管R217I蛋白仍残余部分功能可增加TYR启动子转录活性,但与野生MITF蛋白相比,二者差异有显著统计学意义(P<0.01),而T192fsX18蛋白则完全失去调控TYR启动子转录活性作用(P<0.01);二者均未对野生MITF蛋白功能产生显性负效应(P>0.05)。突变R217I蛋白与野生MITF蛋白均可与TYR启动子特异DNA序列E-box结合,而突变T192fs X18蛋白则不能与之结合。结论 R217I和T192fsX18突变蛋白通过影响靶基因TYR转录活性,使其表达下调、黑色素合成减少,以单倍体剂量不足效应致Ⅱ型WS。 张华 陈红胜 李家大 罗洪金 梅凌云 贺楚峰 冯永关键词:WAARDENBURG综合征 基因突变 体外实验