汤蕾
- 作品数：2 被引量：10H指数：1
- 供职机构：江西省分子医学重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 原癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的影响被引量：10
- 2006年
- 目的:克隆大鼠原癌基因pim-3并构建真核表达重组质粒pEGFP-N2／pim-3,观察他在真核细胞SMMC-7721中的表达情况以及对细胞凋亡的影响．方法:利用TRIzol从液氮保存的大鼠骨骼肌组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获取pim-3 cDNA,并构建重组质粒pEGFP-N2／pim-3,转化用CaCl2法制备的大肠杆菌JM-109菌株,酶切以及测序鉴定．将重组质粒通过脂质体介导转染肝癌SMMC-7721细胞后利用倒置荧光显微镜观察基因表达情况,并利用流式细胞术及MTT比色实验对转染细胞的生物学行为进行检测．结果:将RT-PCR产物全部用于低熔点琼脂糖凝胶电泳、回收,在DL 2000 Marker 1000 bp附近可见清晰条带,与实验设计符合;阳性克隆质粒的酶切电泳和测序结果表明,大鼠pim-3 cDNA的克隆和重组质粒pEGFP-N2／pim-3的构建成功;重组质粒pEGFP-N2/pim-3转染组凋亡细胞占3．5％,质粒pEGFP-N2转染组凋亡细胞占10．7％,而仅加入转染液的空白组凋亡细胞占11．0％,重组质粒转染组与两对照组之间差异有统计学意义(P<0．05);倒置荧光显微镜可以观察到pim-3在SMMC-772 1细胞中的正常表达;MTT比色实验显示原癌基因pim-3能够明显抑制细胞凋亡．结论:真核表达重组质粒pEGFP-N2/pim-3构建成功;原癌基因pim-3能明显抑制肝癌细胞凋亡．
- 邓欢刘亮明张吉翔罗杰尹东熊瑛汤蕾谢正元
- 关键词：肝癌克隆凋亡荧光显微镜流式细胞术
- 人XPD基因转染对人肝癌细胞的生物学影响
- 2013年
- 目的:XPD基因作为TFIIH因子中一员,在基因修复中发挥重大作用。本实验构建带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD,并将其稳定转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞,探讨XPD基因与HBx,Cdk7的相互作用,以及细胞周期和凋亡机制。方法:从人宫颈鳞癌上皮细胞株HeLa细胞克隆出人全长XPD cDNA,构建了pEGFP-N2-XPD重组体质粒,并将其稳定转染入Hep3B并筛选单克隆稳定转染重组质粒Hep3B细胞(Hep3B-pEGFP-N2/XPD)和稳定转染空载质粒Hep3B细胞(Hep3B-pEGFP-N2)。利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达,检测转染XPD基因后细胞内XPD,HBx,Cdk7的表达量变化,并检测细胞的增殖凋亡以及细胞周期变化。结果:(1)利用酶切和基因测序,成功构建了带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD。(2)免疫荧光显微镜下,Hep3B-pEGFP-N2和Hep3BpEGFP-N2-XPD细胞中可观察到绿色荧光蛋白表达。(3)RT-PCR检测:Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞与Hep3B和Hep3B-pEGFP-N2,两对照组相比,HBx mRNA表达明显降低(P<0.001)XPD mRNA表达明显增高(P<0.01)Cdk7 mRNA表达明显降低(P<0.001)。(4)MTT检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照相比,细胞增殖率减弱(P<0.05)。TUNEL检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD与两对照组比较,细胞凋亡明显增加(P<0.01)。流式细胞仪检测示Hep3B-pEGFP-N2/XPD进入S期出现障碍,停滞在G0+G1期的细胞增多,细胞凋亡率逐渐增加。(5)Western blot检测Hep3B-pEGFP-N2/XPD细胞中XPD蛋白相对表达量均比两对照组高,Cdk7蛋白相对表达量均比两对照组低,差异有统计学意义(P<0.001).结论:野生型XPD基因片段成功插入pEGFP-N2空载质粒中,将其稳定转染进人肝癌细胞株Hep3B细胞中,可以在转录和蛋白水平提高细胞XPD表达、降低细胞内HBx Cdk7表达。野生型XPD基因过渡表达可能抑制HBx Cdk7表达来改变细胞周期、抑制细胞生长、促使细胞凋亡。
- 熊瑛张吉翔汤蕾
- 关键词：肝脏肿瘤XPDHBX
