关剑
- 作品数：19 被引量：130H指数：7
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金卫生部临床学科重点项目卫生部科技专项基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- ERK/MAPK通路参与肝癌产生多药耐药的胞内信号传导被引量：15
- 2007年
- 目的探讨微环境诱导肝癌产生多药耐药的胞内信号传导途径。方法分别使HepG2细胞在缺氧、低糖环境下生长或稳定整合 HBX 基因,运用 Western 蛋白印迹法检测这些细胞内 ERK/MAPK 的活性。用 ERK/MAPK 特异性阻断剂 U0126处理这些细胞后,用 Western 蛋白印迹法检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和多药耐药相关蛋白的表达变化,逆转录聚合酶链反应和免疫细胞化学技术分别检测 HIF-1α在 mRNA 水平表达量和部位的改变。结果不同环境下生长的 HepG2细胞中,磷酸化/非磷酸化 ERK/MAPK 比例均有不同程度的增高。用 U0126处理12h 后,这些细胞中 HIF-1α和多药耐药相关蛋白的表达下降,且 HIF-1α表达由胞核向胞质转位,其 mRNA 水平无显著变化。结论 ERK/MAPK 信号通路是微环境诱导肝癌产生多药耐药的重要胞内信号传导途径。
- 朱虹陈孝平罗顺峰关剑张万广张必翔茅彩萍
- 关键词：肝细胞抗药性多药细胞外调节激酶缺氧诱导因子-1Α
- Tet-on基因表达系统反应质粒P^(TRE-HIF-1α)的构建和表达鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的克隆和构建携带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α。方法以缺氧的肝癌细胞株HepG2总RNA为模板,进行RT-巢式PCR,获得HIF-1α的cDNA,克隆入Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE2hyg,酶切重组子鉴定。将构建好的PTRE-HIF-1α用脂质体法转入HepG2Tet-on细胞,在强力霉素的作用下,用RT-PCR及Westernblot法鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1α的cDNA测序结果与Genbank记载完全一致,并成功克隆入PTRE2hyg,将反应质粒PTRE-HIF-1α转入HepG2Tet-on细胞,可以完整有效表达HIF-1α且受强力霉素的调控。结论成功克隆和构建携带HIF-1α基因的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α,并证明其表达能在HepG2Tet-on细胞中受强力霉素调控。
- 徐宗全陈孝平张万广王其关剑李高鹏
- 关键词：低氧诱导因子-1Α巢式PCR克隆
- TRAIL及其受体在肝癌耐药株治疗中的作用被引量：2
- 2005年
- 目的比较肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2的TRAIL受体的表达。及TRAIL对肝癌耐药株HepG2/ADM的治疗作用。方法通过浓度递增法用阿霉素处理人肝癌细胞株HepG2获得肝癌耐药株HepG2/ADM。RT-PCR、Western Blot和免疫组化比较肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2的TRAIL受体及bcl-2、MDR的mRNA和蛋白表达。采用AnnexinV-FITC-PI双染色流式细胞仪测TRAIL对肝癌耐药株HepG2/ADM的调亡诱导作用。结果肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2比较都存在DR4、DR5受体且mRNA和蛋白表达上无差异。DcR1、DcR2在蛋白表达上无差异,但mRNA水平有轻度变化,未达到统计显著性。免疫组化示肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2都存在DR4、DR5受体和DcR1、DcR2受体,分析未见差异。TRAIL对HepG2/ADM及其亲代均有诱导调亡的作用,同样存在一定的耐受现象。但调亡作用两者无显著性差异。结论肝癌耐药株HepG2/ADM与其亲代HepG2都存在DR4、DR5受体和DcR1、DcR2受体。表达无显著性差异。单纯TRAIL治疗对耐药株作用与亲代细胞作用相仿,虽同样存在一定的耐受现象,但受HepG2/ADM耐药性的影响小。TRAIL治疗肝癌耐药株有优势。
- 赵旭陈孝平何松青朱虹关剑丁磊
- 关键词：TRAIL肝癌
- Twist在人肝癌细胞系与正常肝细胞系中的表达差异被引量：6
- 2007年
- 目的研究Twist在人肝癌细胞系HepG2和人正常肝细胞系L02中的表达及其作用。方法利用荧光定量PCR技术及免疫印迹法分别检测TwistmRNA及Twist蛋白在人肝癌细胞系HepG2及人正常肝细胞系L02中表达的差异。结果HepG2细胞的TwistmRNA表达水平为L02的2.36倍(P<0.05),蛋白水平为(3.13±0.21)倍(P<0.05)。结论Twist在肝癌细胞系中的过高表达可能与肝癌的发生、发展有关。
- 关剑陈孝平王其张必翔张万广张志伟
- 关键词：肝肿瘤聚合酶链反应免疫印迹法
- Twist基因表达与肝癌多耐药细胞侵袭的相关性研究被引量：15
- 2006年
- 目的研究胚胎发育相关基因Twist在人肝癌多药耐药细胞系HepG2／ADM中的表达及意义。方法建立肝癌多药耐药细胞系HepG2／ADM,利用荧光定量PCR技术及免疫印记法分别检测Twist mRNA及Twist蛋白;多药耐药相关基因MDR 1mRNA在HepG2／ADM及其亲本细胞HepG2中表达的差异。结果Twist在HepG2／ADM中表达上调,与亲本细胞 HepG2相比,mRNA(9．34 vs 1,P<0．05),蛋白(10．64±0．56 vs1,P<0．05),具有显著性差异,MDR1mRNA表达在HepG2／ ADM中显著上调,是其亲本细胞的348．99倍(P<0．05)。结论 Twist在HepG2／ADM中表达上调,这可能使得HepG2／ ADM转移扩张能力增加。
- 王其陈孝平关剑张万广张必翔
- 关键词：TWIST多药耐药肝细胞癌
- 抑制蛋白激酶Cα活性增加TNF-α对小鼠肝癌细胞毒性的实验研究被引量：2
- 2006年
- 目的探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)及联合蛋白激酶Cα (protein kinase C alpha,PKC-α)抑制剂Go6976对小鼠肝癌(H22)细胞凋亡的影响。方法将处于对数生长期的H22细胞分成两组,每组分四部分,一组仅以不同浓度的TNF-α(0,20、40、60 ng／ml)处理,另一组TNF-α处理同时以Go6976(4．6 nmol／ml)抑制PKC-α活性,分别于4 h,8 h,16 h采用流式细胞仪检测小鼠肝癌细胞的凋亡率,Western blotting方法检测PKC—α和磷酸化PKC-α蛋白的表达情况。结果 TNF-α(0、20、40、60 ng／ml)处理H22细胞4 h,细胞凋亡率分别为2．44％±0．31％、 1．80％±0．32％、2．73％±0．14％、3．05％±0．78％,PKC-α和磷酸化PKC-α表达无显著改变;同时用 TNF-α和Go6976处理H22细胞,凋亡率、PKC-α和磷酸化PKC-α的表达与单独使用TNF-α的结果相似。TNF-α处理8 h,细胞凋亡率分别为2．11％±0．43％、1．83％±0．31％、3．40％±0．47％、6．05％± 0．78％,PKC-α及磷酸化PKC-α的表达随TNF—α浓度增加而上调;TNF—α处理同时抑制PKC-α活性,细胞凋亡率显著升高,分别为2．90％±0．39％、7．76％±0．35％、11．43％±1．05％、12．96％± 2．44％,PKC-α和磷酸化PKC-α表达相应下调。仅以TNF-α处理或TNF—α处理同时抑制PKC-α活性16 h,其结果与8 h的结果基本一致;于Go6976抑制细胞PKC-α活性组,TNF-α60 ng／ml时细胞凋亡率较TNF-α40 ng／ml时有所下降,但坏死细胞的比例却明显升高。结论 TNF-α上调PKC—α和磷酸化PKC-α表达;抑制PKC-α活性,显著增加TNF-α对H22细胞的细胞毒性。
- 侍作亮陈孝平张万广关剑靖凯
- 关键词：蛋白激酶C肝癌细胞毒性
- 脂质过氧化物酶体增殖物激活受体α在人肝癌多药耐药中的作用被引量：4
- 2006年
- 目的研究脂质过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α,PPARα)在人肝癌多药耐药中的作用机制。方法利用透射电镜观察人肝癌多药耐药 (multidrug resistance,MDR)细胞HepG2／ADM及其亲本细胞HepG2的超微结构;荧光定量PCR技术检测PPARα mRNA在两种细胞系中的表达水平;免疫印记法检测PPARα蛋白的在两种细胞中的表达情况。结果人肝癌多药耐药细胞与其亲本细胞相比,耐药细胞的核膜上绒毛样突起增多,胞浆内有大量空泡,粗面内质网增多;HepG2／ADM细胞的PPARα mRNA表达和蛋白表达均有下降。结论PPARα与HepG2／ADM细胞的MDR现象有关,PPARα表达下调可能是肿瘤细胞MDR形成的机制之一。
- 王其陈孝平关剑张万广张必翔
- 关键词：多药耐药
- 肝癌多药耐药产生与低糖环境的关系被引量：11
- 2007年
- 目的探讨局部微环境低糖与肝细胞癌多药耐药性（MDR）产生的关系及影响机制。方法低糖培养HepG2细胞，应用流式细胞术Annexin V／PI法检测低糖培养的细胞在化疗药物5-氟脲嘧啶（5-Fu）作用后的凋亡情况，分别应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术和Western blot技术检测低糖培养后HepG2细胞内多药耐药相关基因mdr1、MRP1、LRP的mRNA和蛋白水平的表达。结果在低糖环境下生长时间越长的HepG2细胞对5-Fu的抵抗越强，而且随着低糖培养时间的增加，5-Fu诱导的HepG2细胞的凋亡高峰延迟。低糖培养的HepG2细胞内多药耐药相关基因mdr1、MRP1、LRP在mRNA和蛋白水平的表达随低糖培养时间的延长而升高，以LRP的改变最为显著。结论肝癌生长微环境葡萄糖耐量不足也是肝癌产生MDR的原因之一。低糖可通过上调一组多药耐药相关基因的表达而诱导肝癌的多药耐药性。
- 罗顺峰陈孝平朱虹关剑张必翔
- 关键词：多药耐药基因表达
- 干扰素α-2b抑制肝癌裸鼠移植瘤的生长作用被引量：1
- 2005年
- 目的:探讨干扰素α-2b对人肝细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型中肿瘤组织环氧合酶-2(COX-2)、血管内皮生长因子(VEGF)表达及肿瘤血管生成的抑制作用。方法:将32只人肝癌皮下移植瘤裸鼠随机分为4组,每组8只。实验按IFN-α-2b不同用量分为治疗A组(10000IU/d),治疗B组(20000IU/d),治疗C组(40000IU/d),对照组注射生理盐水,连续用药35d,观察4组裸鼠肿瘤组织生长增殖状况。应用免疫组化方法检测肿瘤组织COX-2和VEGF的蛋白表达;CD34标记血管内皮细胞测定肿瘤微血管密度(MVD);应用TUNEL方法检测肿瘤细胞凋亡的变化。结果:干扰素-α-2b治疗组肿瘤重量和体积均显著低于对照组(P<0.01),抑瘤率分别为27.78%,65.22%和49.64%;治疗组肿瘤组织COX-2和VEGF表达水平及MVD显著低于对照组(P<0.01);治疗组肿瘤组织中凋亡细胞的比例明显增加,与对照组比较有显著性差异(P<0.01)。治疗B组肿瘤重量和体积、COX-2和VEGF表达水平及MVD、凋亡指数与A组和C组比较有显著性差异(P<0.05),抑瘤效果显著;A组和C组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:干扰素-α-2b抑制荷瘤裸鼠肝癌细胞的生长,诱导肿瘤细胞凋亡,可能与其下调COX-2和VEGF表达有关;干扰素-α-2b治疗肝癌呈一定的量效关系,中等剂量(20000IU/d)抑瘤作用最明显。
- 曹斌陈孝平朱鹏丁磊关剑侍作亮
- 关键词：肝细胞癌干扰素Α-2B环氧合酶-2血管内皮生长因子微血管密度
- 缺氧诱导因子1α依赖性缺氧诱导人肝癌细胞多药耐药相关基因的表达及意义被引量：29
- 2005年
- 目的探讨缺氧环境下人肝癌细胞中多药耐药相关基因和缺氧诱导因子1α(HIF1α)的表达和意义,从而部分阐明肝细胞癌发生多药耐药的机制,为逆转肝癌耐药提供新的分子靶点。方法将人肝癌细胞系HepG2细胞分别行不同时间低氧培养和转染HIF1α/PCDNA3质粒;应用荧光定量聚合酶链反应技术和蛋白免疫印迹技术分别检测每组HepG2细胞中多药耐药相关基因(mdr1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和肺耐药相关蛋白(LRP)在mRNA和蛋白水平的表达。结果在缺氧组,随着缺氧时间的延长HepG2细胞中多药耐药相关基因mdr1、MRP1和LRP的表达均逐渐增高,且以MRP1变化更为显著;而且这些多药耐药相关基因的表达升高与缺氧诱导因子1α的表达呈同步化改变。在HIF1α/PCDNA3质粒转染细胞中这些多药耐药相关基因的表达亦明显升高。结论缺氧可通过核转录因子HIF1α上调肝癌细胞内mdr1,LRP、MRP1等多药耐药相关基因的表达,从而使肝细胞癌获得多药耐药性。生长局部微环境的缺氧是诱导肝癌产生多药耐药性的重要原因之一。核转录因子HIF1α和这些多药耐药相关基因将可能成为逆转肝癌耐药的新的分子靶点。
- 朱虹陈孝平罗顺峰关剑张万广张必翔王海平
- 关键词：多药耐药相关基因人肝癌细胞MRP1缺氧诱导因子1PCDNA3
