杨藩
- 作品数：6 被引量：3H指数：1
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- Sall4表达调控及其启动子核心调控区的筛选
- 2016年
- 【目的】Sall4是一种锌指结构转录因子,对建立和维持动物多能干细胞具有重要意义。为探索猪Sall4的表达和转录调控机制,克隆了猪Sall4启动子,对其进行了功能验证和核心调控区的筛选。【方法】从猪基因组中克隆获得2.1 kb Sall4启动子片段,并构建相应的报告载体;将报告载体p E2.1转染不同种类的细胞,进行细胞特异性表达检测;采用实时荧光定量PCR方法,检测Sall4在猪不同组织和细胞中的表达变化;通过生物信息学方法,分析Sall4启动子上各种关键顺式作用元件和潜在的转录结合位点;将多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b和Smad与Sall4启动子共转染293T细胞,利用双萤光素酶报告系统检测Sall4启动子活性;采用DNA片段缺失的方法,构建一系列Sall4启动子片段缺失报告载体,将缺失片段载体分别转入293T细胞中,并利用双萤光素酶报告系统检测启动子的活性。【结果】Sall4在多能干细胞、生殖细胞和癌化肿瘤细胞中:包括P19、293T、CHO和Hela等细胞中特异性高表达。另外,通过实时荧光定量PCR检测结果显示,Sall4的表达具有明显的组织特异性,其在猪i PS细胞和生殖相关组织,如睾丸和卵巢组织中表达最高,而在脑、心、肝和肌肉等组织中的表达较低,表明该基因与细胞多能性维持具有互作关系。应用JASPAR和GPMiner软件分析发现,Sall4启动子上有TATA box、GC box、CAAT box等顺式作用元件,以及Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Esrra/b、Stat3和Smad等多能转录因子的预测结合位点。其中,Oct4、Sox2和TGF-beta信号通路因子对Sall4启动子活性有较显著的激活作用,与对照组比较Sall4启动子活性提高了3倍;而Klf4因子对Sall4启动子活性有一定的抑制作用。采用分段PCR的方法,对2.1 kb启动子进行了片段缺失,分别构建了p L2.1、p L1.0和p L0.5等3个报告载体,检测结果发现,在p L2.1与p L1.0之间相差1 kb左右,但是启动子的活�
- 王亚娴杨藩王华岩
- 关键词：SALL4启动子多能性转录调控
- 小鼠pMSV-Slfn5-GFP表达质粒构建及基因结构分析
- 2017年
- 目的构建小鼠pMSV-Slfn5-GFP基因重组表达质粒及基因结构分析。方法提取小鼠肝脏组织中总RNA,反转录为cDNA。PCR扩增小鼠Slfn5编码序列片段,并与pGEM-T Easy载体连接,连接产物转化到大肠埃希菌DH5α中。挑取阳性克隆提取质粒,经限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒送Macrogen USA测序。测序正确的质粒通过HindⅢ和XhoⅠ与pMSV-GFP连接,并命名为pMSV-Slfn5-GFP。通过UCSC(http://genome.ucsc.Edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因组结构,并通过NCBI确定Slfn5的蛋白结构域。结果 Slfn5全长基因序列克隆到表达载体pMSV-GFP中,酶切鉴定片段大小为2.65kb。Slfn5的AAA_4蛋白结构域由phylogeny.fr确定了该结构在Slfn蛋白家族中的保守性。结论成功构建了小鼠pMSV-Slfn5-GFP全长基因表达载体。
- 况春燕杨藩
- 关键词：基因结构
- 猪ESRRB启动子克隆及其调控活性检测
- 2015年
- Esrrb(Estrogen related receptorβ)属于雌激素受体家族,是一类在胚胎早期外胚层细胞中表达并对干细胞多能性维持起重要作用的基因。为了探索猪ESRRB的表达和转录调控机制,克隆了3.3 kb ESRRB启动子片段,构建了相应的报告载体。并将报告载体分别转染293T人胚肾细胞、Hela人宫颈癌细胞和小鼠C2C12成肌细胞。通过TFSEARCH和JASPER方法对ESRRB启动子潜在的转录调控位点进行分析,发现该启动子上有SMAD、STAT3、MYC、KLF4等多能转录因子的结合位点。将相应的转录因子与ESRRB启动子共转染,并检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示猪ESRRB启动子具有明显的组织特异性调控,同时SMAD对ESRRB启动子活性有较明显的调控作用。进一步对3.3 kb片段进行了一系列的缺失,发现猪ESRRB核心区域位于5′上游的-25 bp和-269 bp之间。研究结果表明猪ESRRB启动子上潜在的转录因子结合位点及启动子核心区域是参与调控ESRRB表达的重要序列。
- 杨藩王亚娴杜丽霞王华岩
- 关键词：雌激素相关受体启动子多能干细胞转录调控
- 大鼠Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG质粒的构建、基因结构分析及鉴定
- 2017年
- 目的:大鼠Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG基因重组表达质粒的构建及其基因结构分析。方法:通过UCSC(http://genome.ucsc.Edu/)分析大鼠瞬时受体电位通道4(TRPC4)及其家族基因组结构,并通过NCBI确定了TRPC4的蛋白结构域,通过Bio GPS(http://biogps.org/#goto=welcome)分析其表达模式;PCR扩增大鼠TRPC4蛋白编码区域(CDS),并通过限制性内切酶与穿梭载体pDOV-mCMV-MCS-EGFP-3FLAG进行连接,其产物转化细菌感受态细胞;挑取阳性克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序验证,测序正确的克隆即为目的质粒,命名为pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG;将该质粒转染HEK293细胞进行腺病毒包装,并命名为Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG,通过Western blot验证蛋白的表达。结果:生物学分析发现TRPC4蛋白保守的TRP-2、ANK及TRP结构域,通过Bio GPS分析发现TRPC4在杏仁核和海马中表达明显,在血管内皮细胞中也有表达;PCR克隆获得3 000 bp的TRPC4 CDS序列,CDS被亚克隆到表达载体pDOV-mCMVMCS-EGFP-3FLAG中,酶切鉴定及测序验证正确;进行腺病毒包装后的病毒可以在HEK293细胞中表达TRPC4-EGFP-3FLAG融合蛋白,Western blot证实其为含flag标签的蛋白且大小为128 KDa。结论:成功构建了大鼠TRPC4的腺病毒表达载体Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG。
- 况春燕杨藩
- 关键词：基因结构
