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共表达不同水平的IL-12对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响被引量：1: 2010年; 目的在HBsAg DNA疫苗质粒中共表达IL-12佐剂分子,研究IL-12的表达水平对于HBV DNA疫苗质粒免疫原性的影响.方法构建携带来源于中国地区C型HBV参照序列CHN-HBV07-C经密码子优化的preS2-S基因的DNA疫苗质粒pHBV,并将3个不同IL-12表达水平的佐剂分子表达盒序列分别克隆入该疫苗质粒中,通过瞬时转染293T细胞以检测重组质粒IL-12分子及乙肝表面抗原的表达情况.将不同IL-12表达水平的疫苗质粒免疫BALB/c雌性小鼠,IFN-γ的ELISPOT方法检测HBsAg抗原特异性的细胞免疫应答,化学发光定量ELISA法检测HBsAg特异的抗体水平.结果成功构建3个不同IL-12表达水平的HBV DNA疫苗质粒,293T细胞转染结果显示：不携带IL-12分子表达盒的对照疫苗质粒pHBV的HBsAg表达水平可达70 ng/ml;低表达IL-12的疫苗质粒pHBV-12l的HBsAg表达水平为18 ng/ml;而高表达IL-12的重组疫苗质粒pHBV-12h的HBsAg表达水平仅为6 ng/ml.BALB/c小鼠的免疫结果表明：高表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12h所诱导的细胞免疫及体液免疫水平相对于对照疫苗质粒pHBV均显著降低了.低表达IL-12分子的疫苗质粒pHBV-12l所诱导的抗体水平也显著降低了,但其细胞免疫应答水平却显著提高了.结论在同一疫苗质粒中,高表达IL-12分子的质粒可能会影响到抗原蛋白的表达,而低表达IL-12分子的疫苗质粒却能增强细胞免疫应答.因此,平衡好佐剂分子及抗原蛋白的表达水平对于诱导高水平的免疫应答是个重要的因素.; 李鼎锋王贻杰王欢王维龙吉春史洪娜刘新颖沈林刘勇; 关键词：IL-12 乙型肝炎病毒免疫原性

HBsAg/GM-CSF融合蛋白的克隆及其在毕赤酵母中的表达被引量：1: 2005年; 目的在毕赤酵母中表达HBsAg/GM-CSF融合蛋白。方法利用PCR扩增HBsAg和GM-CSF基因,通过15个氨基酸的连接肽将两个片段连接,获得融合基因S-GM,克隆入酵母穿梭质粒pPIC9K中。将重组质粒9K-S-GM电转化毕赤酵母后,G418筛选,甲醇诱导,HBsAg/GM-CSF融合蛋白表达。经SDS-PAGE检测表达水平,Western blot检测表达产物特异性。结果PCR扩增的片段与预期大小一致,HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中获得了表达。Western blot检测,该融合蛋白同时具有HBsAg和GM-CSF的特异性。结论该融合蛋白的获得为提高乙肝疫苗的免疫原性奠定了科学基础。; 席晓蓉李鼎锋孙强明杨芳易山孙茂盛; 关键词：HBSAG GM-CSF 融合蛋白克隆技术毕赤酵母乙型肝炎疫苗

两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其免疫原性比较: 2007年; 目的:利用毕赤酵母表达系统表达两种融合形式的乙肝病毒表面抗原(HBsAg-s和s-HBsAg),并对融合蛋白的免疫原性进行研究。方法:用毕赤酵母分泌型表达质粒pPIC9k为载体,通过PCR方法引入(Gly4Ser)3连接肽的编码基因将GM-CSF融合到HBsAg基因的3′端或5′端进行分泌表达,表达产物以SDS-PAGE及Western blot进行分析并通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱进行蛋白纯化。将纯化的两种融合蛋白与单纯的HBsAg蛋白分别免疫小鼠,ELISA方法检测HBsAg特异的抗体反应水平。结果:两种HBsAg/GM-CSF融合蛋白均可在毕赤酵母菌株GS115中获得了分泌表达,Western blot分析表明表达产物能够与抗GM-CSF抗体及抗HBsAg抗体发生特异性结合。免疫后的血清ELISA结果显示,相比单纯的HBsAg蛋白,两种融合蛋白可以诱导出更高的抗体水平(P<0.05),其中将GM-CSF蛋白融合在HBsAg蛋白的C端效果要好于融合在N端。结论:通过与GM-CSF蛋白的融合可以显著增强HBsAg的免疫原性,这为提高乙肝疫苗的免疫效果提供了新的思路与方法。; 易山席晓蓉施锐杨芳李敏李鼎锋孙茂盛; 关键词：HBSAG GM-CSF 融合蛋白毕赤酵母免疫原性

DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗小鼠体内生物分布研究被引量：4: 2011年; 目的考察DNA-天坛痘苗复合型艾滋病疫苗在小鼠体内生物分布情况。方法采用定量PCR方法分别对复合疫苗免疫后DNA疫苗的分布情况以及复合疫苗组分HIV-痘病毒载体疫苗单独免疫后的生物分布情况进行测定。结果复合疫苗免疫后5d和30d,主要是在注射部位检测到质粒DNA残留,在免疫后第56d,各脏器均未检测到质粒DNA残留。HIV-痘病毒载体疫苗单独免疫后第5d,仅在给药部位检测到DNA残留,免疫后第36d,各脏器均未检测到DNA残留。结论复合疫苗免疫机体后短期只在注射部位分布,且随时间延长减少至消失,不会长期在机体内存留。; 霍艳李鼎锋王三龙段丹丽刘颖刘勇王军志邵一鸣李波; 关键词：DNA疫苗艾滋病疫苗生物分布小鼠

塞姆利基森林病毒翻译增强序列对HIV Gag DNA疫苗抗原表达和免疫原性的调节被引量：2: 2005年; 目的研究塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)衣壳蛋白5′翻译增强区对基于该病毒复制子的HIVGagDNA疫苗抗原表达水平和免疫原性的影响。方法将SFV衣壳蛋白(capsid,C蛋白)基因的5′端102bp翻译增强区插入到SFV复制子DNA疫苗载体pCMVRep的SFV亚基因启动子下游,得到DNA疫苗载体pCMVRepC。将删除ATG的HIV1gag基因插入pCMVRepC,使gag编码区与翻译增强区融合,得到DNA疫苗质粒pCMVRepCgag。同时,构建携带未融合翻译增强序列的DNA疫苗质粒pCMVRepgag。Westernblot检测翻译增强序列对Gag表达水平的影响。用上述两种DNA疫苗分别免疫BALBc雌性小鼠,ELISA检测Gag特异的抗体反应,ELISPOT和细胞内因子染色技术检测细胞免疫应答。结果衣壳蛋白5′翻译增强区增强了Gag表达水平,对体液免疫应答没有显著影响,但显著增强了特异性细胞免疫应答水平。结论SFVC蛋白翻译增强区能显著提高SFV复制子DNA疫苗的抗原表达和抗原特异性细胞免疫反应。; 张玉伟周克民李鼎锋李海山范文玲徐建青孙茂盛刘勇邵一鸣; 关键词：DNA疫苗抗原表达免疫原性 GAG 特异性细胞免疫应答翻译

表达具有免疫激活功能的单链RNA的DNA疫苗载体及其用途: 本发明公开了一种用于提高DNA疫苗免疫原性的表达载体，该载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的单链RNA(ssRNA)的DNA序列。本发明还公开了一种重组质粒，其包含上述表达载体和插入所述表达载体中的编码抗...; 邵一鸣张玉伟李鼎锋刘勇; 文献传递

体内电穿孔对报告基因表达和HIV Gag DNA疫苗诱导的免疫反应的影响被引量：5: 2006年; 目的研究体内电穿孔递送途径在小鼠模型中对于报告基因表达水平及HIV Gag DNA疫苗所诱导的免疫反应的影响。方法构建荧光素酶(luciferase)表达质粒p1．0-luc,将其通过直接肌肉注射、肌注后以双针电极进行电穿孔、肌注后以钳式电极进行电穿孔等3种不同方法注射小鼠,72h后取注射部位的肌肉测定luciferase的表达情况。同时构建携带密码子优化的HIV-1B′/C重组亚型CN54株gag基因的DNA疫苗质粒p1．0-gag,在10μg、100μg两个剂量水平上通过以上3种不同的方法免疫BALB/c雌性小鼠,ELISA方法检测Gag特异的抗体反应,ELISPOT方法和细胞内因子染色(jntracellular cytokine staining,ICS)技术检测细胞免疫应答。结果通过体内电穿孔可以使luciferase在小鼠肌肉中的表达水平显著提高,最大提高幅度达到66倍。Gag DNA疫苗免疫结果显示,电穿孔可以显著提高Gag特异的体液免疫应答,其中使用双针电极的效果要显著好于钳式电极,前者所诱导的抗体滴度比不使用电穿孔组提高可达28倍。但体内电穿孔对于Gag特异的细胞免疫应答并没有显著影响。结论体内电穿孔(尤其是使用双针电极)可以大幅度提高报告基因在体内的表达水平和DNA疫苗诱导的抗原特异性体液免疫应答。; 李鼎锋张玉伟李海山范文玲孙茂盛刘勇邵一鸣; 关键词：DNA疫苗基因表达

表达具有免疫激活功能的发夹RNA的DNA疫苗载体及其用途: 本发明公开了一种用于提高DNA疫苗免疫原性的表达载体，该载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的发夹RNA(hairpin RNA)的DNA序列。本发明还公开了一种重组质粒，其包含上述表达载体和编码抗原的外源...; 邵一鸣李鼎锋刘勇张玉伟; 文献传递

重组HIV-1 CN54 Nef抗原的制备及鉴定: 2007年; 目的原核表达HIV-1CN54调控蛋白Nef,并进行纯化、复性及鉴定。方法将CN54 Nef基因克隆至pThio-HisA载体,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21 Codonplus-RIL,IPTG诱导表达,通过尿素梯度洗涤包涵体纯化Nef蛋白,透析复性。Western blot检测目的蛋白的特异性。结果Nef蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上。用尿素洗涤法可直接纯化Nef,纯度达到90%以上。Nef蛋白透析后溶解于PBS缓冲液中。Western blot检测显示了良好的特异性。结论HIV-1 CN54 Nef抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达,采用的纯化和复性Nef蛋白的工艺简便、快捷,为开发针对Nef基因的HIV-1疫苗奠定了基础。; 马涛李鼎锋傅晶晶李亮助孙茂盛刘勇邵一鸣; 关键词：NEF蛋白 DNA疫苗原核表达

表达具有免疫激活功能的单链RNA的DNA疫苗载体及其用途: 本发明公开了一种用于提高DNA疫苗免疫原性的表达载体，该载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的单链RNA(ssRNA)的DNA序列。本发明还公开了一种重组质粒，其包含上述表达载体和插入所述表达载体中的编码抗...; 邵一鸣张玉伟李鼎锋刘勇; 文献传递

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李鼎锋

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