李越
- 作品数：5 被引量：11H指数：2
- 供职机构：中国科学院上海生命科学研究院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生环境科学与工程更多>>
- 2,5-DKG还原酶I的分离纯化与性质研究
- 2005年
- 欧文氏菌ER97高效表达了从棒状杆菌SCB3058克隆的2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)还原酶I基因,5 L罐发酵后,收集菌体破碎,将胞内可溶性的蛋白通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析和Phenyl Sepharose CL-4B疏水柱层析后分离纯化到了2,5-DKG还原酶I,纯化了5倍,得率27%,比活力为3,418 U/mg。测定了该酶的一些特性参数:分子量为34 kD,等电点为6.0,它以NADPH为辅酶,将2,5-DKG还原为2-酮基-L-古龙酸(2-KLG),对NADPH和2,5-DKG底物的Km值分别是0.29mmol/L和14.7 mmol/L,1 mmol/L Cu2+、Zn2+等有强烈抑制作用,EDTA和巯基乙醇对该酶没有抑制作用,酶的最适pH为7.0,最适反应温度为40℃。
- 李越陈策实尹光琳
- 2，5－DKG还原酶II基因的表达研究
- 李越
- 关键词：克隆SD序列
- HOX11基因的转录后调控研究
- HOX11基因属于同源异形盒基因,对于脾的发育具有关键性作用.HOX11的失控表达是T细胞急性淋巴系白血病(T-ALL)发生和发展的关键事件之一.因此HOX11的调控研究对于理解T-ALL的发生和脾发育的机制具有非常重要...
- 李越
- 关键词：ARE转录后调控
- 文献传递
- 2,5-DKG还原酶Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达被引量：3
- 1999年
- 参照文献上的2，5-二酮基-D-葡萄糖酸（简称2，5-DKG）还原酶II基因序列，合成两个引物序列并在两端加上EcoRI和BamHI两个酶切位点，抽提棒状杆菌SCB3058菌株的染色体为模板进行PCR反应，克隆得到2，5-DKG还原酶II基因，酶切验证与预期的结果相符合。将此片段克隆到pGEM-T载体上保存．将2，5-DKG还原酶II基因用EcoRI和BamHI内切酶切下，连接到pBV220载体上，构建成表达载体。42℃诱导不能得到稳定的蛋白表达条带和酶活力，测序发现基因的3’末端的原PCR引物外少合了一个碱基，终止密码子发生移码突变而消失。此外在5’端的启始密码子ATG前有三个碱基与pBV220载体上的SD序列发生配对。据此，重新设计和合成了PCR引物，并用pBV220和pBL4载体构建了两个表达载体。42℃诱导表达均得到了稳定的表达条带和较高的酶活力．
- 李越陈策实尹光琳
- 关键词：PCR克隆
- 欧文氏菌2-酮基醛糖还原酶基因敲除的研究被引量：8
- 2000年
- 根据已知基因序列 ,利用PCR技术 ,从克隆质粒和欧文氏菌 (Erwiniasp .)SCB1 2 5染色体中重新扩增得到含有 2 酮基醛糖还原酶A和B( 2 KRA和B)基因的片段 ,分别用于基因表达和敲除。用于表达的片段定向连接到表达载体 pBL并转化大肠杆菌DH5α后 ,获得高酶活表达。在证实发生了突变的基因表达产物仍具有酶活的基础上 ,对其进行基因敲除的研究。在体外将链霉素抗性基因插入到tkrA内部使其突变失活并作为阳性筛选标记 ,再将此突变基因构建到分配不稳定型质粒pBR32 2上 ,导入宿主菌后与染色体上正常基因进行同源重组交换 ,筛选质粒丢失的阳性菌落进行进一步鉴定。这项工作将为阻断旁路代谢 ,实现从葡萄糖一步发酵产生维生素C前体 2 酮基古龙酸 ( 2 KLG)打下基础。
- 陈芳陈策实李越尹光琳
- 关键词：维生素C基因敲除欧文氏菌
