曹利民
- 作品数：35 被引量：104H指数：6
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金：卫生部科学研究基金国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 靶向Melittin溶酶体破膜与Tat介导的跨膜功能研究
- 本研究将利用抗体库技术，体外筛选、克隆、表达去唾液酸糖蛋白受体的单链抗体，并对单链抗体的靶向性进行分析，观察重组scFv-Melittin肝脏的靶向能力以及破溶酶体膜功能，并探讨重组Tat-TK融合蛋白的跨膜效应，为进一...
- 曹利民
- 关键词：人源噬菌体抗体库去唾液酸糖蛋白MELITTIN靶向跨膜
- 文献传递
- 抗弓形虫靶向抗菌肽的构建及其效应的初步评价被引量：7
- 2005年
- 目的构建弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1与爪蟾抗菌肽(magainin)的融合基因,在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化的靶向抗菌蛋白抗弓形虫感染的效果。方法根据弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1的编码序列设计引物从噬菌粒S1/pIT-2中扩增到S1基因;以其为模板,加入接头抗菌肽序列,采用重叠PCR法扩增得到S1基因与爪蟾抗菌肽的融合基因(S1M),将其克隆到原核表达载体pET-32c中,构建成S1与爪蟾抗菌肽基因的重组表达质粒S1M/pET-32c;测序验证后转化E.coliBL21,以IPTG诱导表达,用Ni2+螯合柱亲和纯化融合蛋白S1M,SDS-PAGE检测融合基因的表达和纯化的融合蛋白S1M;分别采用体内和体外试验观察纯化的靶向抗菌蛋白抗弓形虫感染效果。结果测序结果表明,成功地将弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1与爪蟾抗菌肽的融合基因构建到原核表达载体pET-32c中;SDS-PAGE显示IPTG诱导表达的融合蛋白S1M大小约为43kDa,与预期的大小相一致,以包涵体的形式存在;通过变性条件下Ni2+亲和柱纯化获得S1M重组融合蛋白;体内和体外试验证实,经靶向抗菌蛋白处理过的弓形虫对小鼠的致病能力下降,应用靶向抗菌蛋白的弓形虫感染小鼠的存活时间与对照组相比有明显的提高。结论以抗弓形虫速殖子人源单链抗体作为靶向分子,以爪蟾抗菌肽作为效应分子,构建成功的靶向抗菌蛋白通过体内、外试验证实,具有一定的抗弓形虫感染的作用,虽然还不能完全杀灭弓形虫,但是在弓形虫生物治疗药物的研制方面进行了有益的探索,为弓形虫病的生物治疗提供了新的思路。
- 司进朱荫昌曹利民王晓婷梁幼生管晓虹
- 关键词：弓形虫单链抗体抗菌肽靶向
- 双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究被引量：1
- 2002年
- 目的:构建高靶向性基因转移及表达系统,并研究其介导HSV-tK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法:通过重组技术分别构建anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白表达载体ScFv-GAL4-pET28a及合AFP启动子、GAL4特异性识别序列(GAL4rec)的HSV-tk真核表达载体pEBAF/tk-GAL4rec。IPTC诱导后,利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tk-CAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2,SMMC7721及A549。潮霉素筛选后,MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。结果:双酶切鉴定、SDS-PAGE电泳及测序分别证明anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白及重组pEBAF/tk-CAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中,高分泌AFP(845ng/ml)的HepG2/tk细胞对GCV很敏感,且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关;而低分泌AFP(2ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感;不分泌AFP的A549/tk细胞则不敏感。结论:双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建成功,并显示出很好的靶向性。
- 王骞曹利民周华荣朱慧芬张悦邵静芳杨敬沈关心
- 关键词：HSV-TK基因转铁蛋白受体肝癌
- ASGPR单链抗体-蜂毒肽融合蛋白的构建及其溶红细胞效应被引量：1
- 2007年
- 去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）是一种异源低聚物的内吞受体，定位于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，在介导肝脏疾病靶向治疗方面具有潜在应用价值。我们在获得抗ASGPR单链抗体CI的基础上，
- 曹利民朱慧芬赵晓蓉叶庆吴砂李文涵赵晓萍朱荫昌司进沈关心
- 关键词：单链抗体细胞效应融合蛋白去唾液酸糖蛋白受体蜂毒肽肝脏疾病
- 刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定被引量：2
- 2007年
- 目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。
- 曹利民潘宇红卢志贤陈江陈蓉芳程华莉姜东林司进章辉朱荫昌
- 关键词：弓形虫抗原B细胞表位
- 蜂毒溶血肽在肿瘤生物治疗中的研究被引量：1
- 2006年
- 蜂毒溶血肽(MLT)是意大利蜜蜂(apis mellifera)毒的主要成分之一,由26个氨基酸组成,以往临床上主要用于治疗自身免疫性疾病。但近20年来,先后发现对多种实验性肿瘤有强烈的杀灭作用,引起了人们的极大关注。现综述近年来在研究蜂毒溶血肽治疗肿瘤、提高基因转染效率等诸方面的研究进展。
- 王炜煜曹利民
- 关键词：肿瘤抗肿瘤药
- 去唾液酸糖蛋白受体单链抗体与绿色荧光蛋白的融合表达及其靶向性观察被引量：3
- 2006年
- 目的:表达和纯化去唾液酸糖蛋白受体单链抗体C1与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白,体外观察其肝癌细胞的特异性结合能力。方法:通过扩增构建成含C1与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的原核表达质粒GFPC1/pET-26b;测序验证后转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达,荧光显微镜下观察融合基因中GFP的表达情况;用Ni2+螯合柱亲和纯化融合蛋白GFPC1,SDS-PAGE检测融合基因的表达和纯化的融合蛋白GFPC1;纯化的融合蛋白GFPC1与HepG2细胞经体外孵育后在荧光显微镜下观察单链抗体C1对肝癌细胞的靶向作用。结果:IPTG诱导表达后在荧光显微镜下可以观察到大肠杆菌发出特异性的绿色荧光;SDS-PAGE显示表达的融合蛋白GFPC1,与预期的大小相一致,以包涵体的形式存在;通过变性条件下Ni2+亲和柱纯化获得较GFPC1重组融合蛋白,免疫荧光检测表明纯化的GFPC1可与HepG2细胞膜特异结合。结论:利用GFP作为标记分子,观察到去唾液酸糖蛋白受体单链抗体C1与HepG2细胞膜较强的结合能力,为应用C1对肝癌进行靶向生物治疗奠定基础;构建成功的GFP/pET-26b原核表达系统为其他靶分子的研究提供了一个有力的工具。
- 卢志贤陈江程华莉潘宇红曹利民
- 关键词：肝癌单链抗体增强型绿色荧光蛋白
- Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应
- 2006年
- 目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含pET-32c-Tat 11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达，表达产物用Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat 11-TK的膜结合特性，蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力，检测和分析TK／GCV、Tat 11-TK／GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果：表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60700左右显示条带，符合Tat 11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化获得的Tat 11-TK重组融合蛋白，经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，蛋白印迹结果说明Tat 11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内，同时应用低浓度前药更昔洛韦（GCV，150 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞生长。结论：Tat 11-TK在原核系统获得高效表达，具有较强的穿膜能力和前药酶活性。
- 曹利民王炜煜赵晓蓉叶庆雷萍刘静代维朱荫昌司进沈关心
- 关键词：HIV-1TATHSV1-TK蛋白转导肝癌基因治疗
- 重组同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的表达纯化及表征
- 目的：研究以包涵体形式表达的重组同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的表达、纯化,对其活性进行检测并对其酶学性质进行表征.
方法：将同型半胱氨酸α,γ-裂解酶的重组表达载体pET-15b/rHCYase转化大肠埃希菌BL...
- 王利群孙培培曹利民奚学志王炜煜
- 关键词：基因表达酶学性质药理活性
- 文献传递
- 去唾液酸糖蛋白受体单链抗体靶向蜂毒肽的体外抑瘤效应研究被引量：1
- 2006年
- 目的探讨抗去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)单链抗体C1与蜂毒肽(Melittin)重组蛋白C1M靶向抑制肝癌细胞的效果。方法将含C1M/pGC的XL1-Blue转化菌通过IPTG诱导表达。表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,免疫组织化学技术分析重组蛋白C1M的抗原结合能力,四氮唑盐(MTT)法检测C1M对肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用。结果原核表达质粒C1M/pGC在XL1-Blue中获得有效表达;表达产物以可溶性形式存在;纯化的C1M相对分子量为29.4×103;免疫组化结果表明C1M能有效识别去唾液酸糖蛋白受体,与HepG2(C1M)共培养3d,细胞生长抑制率达92.0%。结论在大肠埃希菌中成功表达C1M,位于C端的Melittin蜂毒肽能有效抑制肿瘤细胞的生长,为体内研究Melittin的靶向抗肝癌效果奠定了基础。
- 曹利民赵晓蓉叶庆雷萍吴砂代维朱慧芬朱荫昌司进沈关心
- 关键词：蜂毒肽重组免疫毒素单链抗体
