王朝文
- 作品数：10 被引量：54H指数：4
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- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 大肠杆菌LTB增强PRRSV-GP5蛋白免疫反应的研究被引量：2
- 2010年
- 以猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)主要中和表位所在的糖蛋白GP5为模式抗原,采用肌肉注射、皮下注射和滴鼻免疫方式免疫6～8周龄ICR小鼠,利用间接ELISA检测血清抗体,MTT法检测淋巴细胞增殖.结果表明:三免后GP5弗氏佐剂乳化组小鼠血清抗体的水平最高,LTB+GP5免疫组的抗体水平显著高于单独GP5免疫组,肌肉注射免疫组的抗体水平明显高于皮下注射组,滴鼻免疫组没有检测到特异性血清抗体;各GP5免疫组均能不同程度地诱导脾脏B淋巴细胞增殖,其中GP5弗氏佐剂乳化组、LTB+GP5肌肉注射和LTB+GP5皮下注射组B淋巴细胞增殖显著,除了GP5弗氏佐剂乳化免疫组外,其他各免疫组均无明显的脾脏T淋巴细胞增殖反应.
- 王朝文吴润王一成袁秀芳徐丽华李军星路斌
- 关键词：PRRSVGP5蛋白免疫佐剂
- 猪流行性腹泻病毒CH/ZJ分离株S基因的克隆、原核表达和免疫原性分析被引量：11
- 2010年
- 为了获得具有免疫活性的猪流行性病毒S蛋白,试验参照GenBank中所收录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株S基因序列设计1对特异性引物,去除信号肽,以PEDVCH/ZJ株为模板,通过RT-PCR扩增出目的基因,克隆入原核表达载体pET28a(+),转化到Top10感受态细胞中,测序并分析。结果表明:目的基因含有1个长966bp、编码322个氨基酸残基组成的多肽;与CV777株相比较,同源性为96.0%,但在398bp处缺失编码1个异亮氨酸的密码子,将重组质粒命名为pET-P-SP1;将pET-P-SP1转化到大肠杆菌E.coliBL21-DL3(Rosetta)中,在IPTG诱导下表达;通过SDS-PAGE表达出与预期大小相符的约35.6ku的重组蛋白,重组蛋白以包涵体形式存在;表达产物占菌体蛋白的80%;表达蛋白能与抗猪流行性腹泻病毒高免血清反应,说明该重组蛋白具有免疫活性。
- 刘邓冉多良袁秀芳徐丽华牛登元张存王朝文王一成
- 关键词：猪流行性腹泻病毒S基因原核表达免疫学活性
- TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用被引量：22
- 2010年
- 根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒Ⅳ基因序列，设计了一对特异性引物和探针，扩增长度为186bp的片段。以克隆Ⅳ基因的质粒作为阳性标准品，建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法在10^9-10^1copies／μL范围内具有良好的线性关系，可检测到初始模板中10copies／μL的质粒DNA，以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时，均检测不到荧光信号，而重复性实验中其变异系数均小于2％，表明此方法具有很好的特异性和重复性。应用此方法对采集的60份，陆床样品进行检测，其阳性检出率为92％，而用常规RT-PCR方法进行检测，阳性检出率仅为80％。表明荧光定量RT-PCR方法的敏感性明显高于常规PcR检测方法。
- 刘邓袁秀芳冉多良徐丽华牛登元王朝文王一成
- 关键词：猪流行性腹泻病毒荧光定量RT-PCR
- 浙江省副猪嗜血杆菌流行株分离鉴定及药敏试验被引量：2
- 2011年
- 为了研究浙江省副猪嗜血杆菌流行菌株耐药性,试验从浙江省杭州、嘉兴、湖州、绍兴和金华等地区8个不同规模猪场典型病例中分离鉴定出了13株副猪嗜血杆菌临床分离株,采用纸片法检测了其对21种临床常用药物的耐药性。结果表明:浙江省副猪嗜血杆菌分离株对大多数常用抗生素敏感,如多西环素、氟苯尼考、阿奇霉素等,对氨苄西林、复方新诺明、头孢类抗生素有较强的耐药性;不同分离株的耐药性有较大的地域、猪场甚至是猪只或分离部位差异。
- 李军星王一成袁秀芳徐丽华路斌王朝文
- 关键词：副猪嗜血杆菌药物敏感性
- 猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重RT-PCR鉴别方法的建立被引量：12
- 2009年
- 根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA聚合酶和Mg2+浓度、退火温度(Tm)等PCR反应条件的优化,最终确定该双重RT-PCR的最佳条件为TaqDNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,Mg2+浓度为0.05 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Tm为51℃。特异性和敏感性检测结果显示,所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性。
- 刘邓袁秀芳徐丽华牛登元王朝文王一成
- 关键词：猪流行性腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒
- 猪腹泻大肠杆菌LTa(R210G)和LTb原核表达及其在小鼠的免疫反应
- 2009年
- 大肠杆菌不耐热性肠毒素(LT)具有免疫增强作用,是良好的免疫佐剂。为了更好的研究其免疫增强效果,本研究将LT的两个亚基LTa(R210G)和LTb克隆到pGST中,原核表达LTa(R210G)和LTb,经Western-blotting分析,表达蛋白具有免疫原性。对表达蛋白进行大量纯化后,以卵清蛋白为模式蛋白(OVA)为模式蛋白,免疫小鼠,ELISA结果表明,OVA+LTa(R210G)佐剂组小鼠的抗体滴度最高,OVA+LTb和OVA+LTa+LT组抗体滴度相似,高于OVA+氢氧化铝组,而OVA+氢氧化铝组高于无佐剂OVA组。因此,LTa(R210G)和LTb具有良好的免疫增强作用,是一种极有希望的免疫佐剂。
- 袁秀芳王一成徐丽华刘邓牛登元王朝文
- 关键词：原核表达免疫反应
- pCI-LT(R210G)基因疫苗的免疫原性研究
- 2009年
- 袁秀芳徐丽华王一成牛登元刘邓王朝文
- 关键词：产肠毒素大肠杆菌免疫原性基因疫苗PCI不耐热肠毒素仔猪黄痢
- 猪大肠杆菌LT基因位点突变、真核表达及小鼠免疫效果
- 2010年
- 大肠杆菌不耐热性肠毒素具有免疫增强的作用,为了更好的研究LT免疫增强效果,我们从临床分离大肠杆菌,提取基因组DNA,扩增出大肠杆菌不耐热性肠毒素基因LT,经位点突变,将LT210位的A突变为G,突变后的LT克隆到真核表达载体pCI质粒中,命名为pCI-LT(R210G),磷酸钙共沉法转染IBRS细胞证实LT(R210G)体外获得表达。将pCI-LT(R210G)免疫小鼠,ELISA结果表明:免疫小鼠两周后体内检测到特异性抗LT抗体,4周达到最高值。同时,MTT试验结果表明免疫小鼠产生强烈的淋巴细胞增殖反应。研究结果证明已成功构建pCI-LT(R210G)真核表达质粒,是一种极有发展前景的基因疫苗。
- 袁秀芳王一成徐丽华刘邓牛登元王朝文
- 关键词：位点突变真核表达免疫反应
- 猪主要RNA病毒病多重二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用被引量：5
- 2010年
- 通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒病进行检测。用50份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为93%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。
- 路斌王一成吴润袁秀芳徐丽华李军星王朝文
- 关键词：CSFVPRRSVJEV
- 大肠杆菌LTB增强PRRSV-GP5蛋白免疫原性的研究
- 【目的】为研究LTB的佐剂特性,在对LTB和GP5进行了表达条件及纯化方法优化的基础上,以LTB为免疫佐剂,GP5为模式抗原进行小鼠及仔猪免疫试验,为研究新型PRRSV疫苗探寻新途径。 【方法】对GP5蛋白原核表达的诱导...
- 王朝文
- 关键词：PRRSVGP5免疫原性免疫增强
- 文献传递
