- KAP-1对胰腺癌细胞Capan-2上皮细胞间质转化的促进作用被引量：4
- 2013年
- 目的研究KAP-1对胰腺癌细胞Capan-2上皮细胞间质转化（EMT）的调节作用。方法构建LV-plenti-GFP。KAP-1慢病毒载体。将Capan-2细胞分为实验组（转染LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体）、阴性对照组（转染空载体）以及空白对照组1（含10％小牛血清的1640培养基）；而后再将实验组Capan-2细胞分为抑制剂组（转染化学合成的miR-100-5p抑制剂）、空载体对照组（转染无关序列micro-RNAs抑制剂）、空白对照组2（含10％小牛血清的1640培养基）。用双酶切及测序鉴定慢病毒并计算病毒滴度。LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体稳定转染至Capan-2细胞后，观察细胞的形态学改变。应用实时定量PER检测各组细胞中KAP-1、EMT标志蛋白以及miR-100-5pmRNA的表达情况。应用Westernblot法检测各组细胞中KAP-1、EMT标志蛋白表达水平。计量资料采用x-±s表示，组间比较均采用方差分析。结果成功构建LV-plenti-GFP-KAP-1慢病毒载体，病毒滴度为2×10^8 TU／ml。慢病毒载体转染Capan-2细胞48h后，实验组细胞与对照组比较其形态有明显间质样改变。实验组、阴性对照组、空白对照组1细胞中各目标蛋白mRNA的相对表达量：KAP-1分别为1．77±0．83、5．03±0．29、5．13±1．14，N-钙黏蛋白分别为2．62±0．71、5．07±1．53、5．81±1．49，波形蛋白分别为2．50±0．21、3．83±0．57、4．92±0．90，E-钙黏蛋白分别为7．20±1．17、7．83±0．78、3．07±0．36，miR-100-5p分别为1．81±0．40、7．01±0．96、6．87±0．35，3组比较，差异有统计学意义（F=5．99，7．62，7．88，6．62，4．64，P〈0．05）。抑制剂组、空载体对照组、空白对照组2细胞中KAP-1mRNA的相对表达量分别为1．56±0．42、4．89±0．61、5．20±0．38，3组比较，差异有统计学意义（F=5．14，P〈0．05）；波形蛋白mRNA的相对表达量分别为3．10±1．37、3．44±0．94、3．08±1．16，3组比较，差异无
- 孙诚谊江建新潘耀振詹磊
- 关键词：胰腺肿瘤上皮细胞间质转化微小RNA
- KRAB-相关蛋白1对胰腺癌细胞化疗耐药性的影响
- 2014年
- 目的 观察KRAB-相关蛋白1（KAP-1）对胰腺癌Capan-2细胞株化疗耐药的影响.方法 PCR扩增KAP-1序列,克隆至pGC-FU-3 FLAG-IRES-Puromycin慢病毒表达载体；双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装并进行滴度检测.构建成功后感染人胰腺癌细胞株Capan-2细胞,48 h后使用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）以及Westem blot法检测KAP-1的表达量及其相关上皮-间充质转化（EMT）标志蛋白——波形蛋白的表达.采用细胞计数试剂盒（CCK-8）方法测定不同化疗药物在不同浓度下过表达KAP-1的Capan-2细胞生长及化疗药物对胰腺癌细胞的生长抑制作用.结果 构建的慢病毒载体感染细胞48 h后,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光,病毒滴度为2＆#215;108 TU/ml.RT-qPCR检测结果表明,实验组、阴性对照组、空白对照组细胞中KAP-1的mRNA相对表达量分别为9.48±0.73、0.03±0.00、0.02±0.00,差异有统计学意义（P＜0.05）；波形蛋白的mRNA相对表达量分别为7.84±0.21、0.63 ±0.07、0.59±0.12,差异有统计学意义（P＜0.05）.Western blot检测结果表明：实验组、阴性对照组、空白对照组细胞中KAP-1的蛋白相对表达量分别为2.73±0.97、0.63±0.36、0.51±0.14,差异有统计学意义（P＜0.05）；波形蛋白的相对表达量为4.75±0.53、1.00±0.26、1.25±0.91,差异有统计学意义（P＜0.05）.转染过表达KAP-1慢病毒载体的Capan-2细胞株在吉西他滨、5-氟尿嘧啶、顺铂作用下的50％生长抑制所需药物浓度（GI50）值分别为27.53、3.96、3.18；阴性对照组及空白对照组分别为0.28、0.15、0.39；0.14、0.21、0.27,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 构建了高效稳定表达KAP-1的慢病毒转染系统.KAP-1转录因子可以减慢人类胰腺癌细胞Capan-2细胞株在化疗药物的作用下的增殖速度,并降低该细胞对化疗药物的敏感性.其机制可能与过表达KAP-1影响波形蛋白上调有关.
- 詹磊江建新潘耀振孙诚谊
- 关键词：胰腺癌化疗耐药性波形蛋白
- Rho家族蛋白在胰腺癌组织中的表达及临床意义被引量：1
- 2014年
- 目的研究Rho家族中3个重要成员RhoA、RhoB、RhoC在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。方法运用免疫组织化学SP法检测43例胰腺癌组织及25例正常胰腺组织中RhoA、RhoB、RhoC蛋白的表达情况,并分析它们的表达与胰腺癌临床病理特征之间的关系。结果 RhoA、RhoC蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为76.7%和72.1%,在正常胰腺组织中的阳性表达率分别为28.0%和20.0%,两者比较差异均有统计学意义(P<0.05);RhoB蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率为4.7%,在正常胰腺组织中的阳性表达率为32.0%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);RhoA、RhoC蛋白表达均与胰腺癌的分化程度、肿瘤分期、有无淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论 RhoA、RhoC蛋白的表达与胰腺癌的发生发展、浸润转移密切相关。
- 黄洋潘耀振江建新王敏李旭何燕浙詹磊孙诚谊
- 关键词：胰腺癌免疫组织化学
- siRNA沉默KAP-1表达抑制胰腺癌细胞PANC-1的侵袭能力被引量：1
- 2013年
- 目的:观察siRNA沉默KAP-1基因表达对人胰腺癌PANC-1细胞侵袭能力的影响,探求该基因作为治疗靶点的可行性.方法:针对KAP-1基因设计5条siRNA,构建真核表达载体,转染293T细胞筛选RNAi有效靶点,包装成重组慢病毒Lv-siRNA-KAP-1,感染胰腺癌细胞PANC-1成功后RT-qPCR检测RNA干扰沉默效果,Transwell小室检测细胞侵袭能力.Western blot检测波形蛋白表达.结果:转染48h后,5条siRNA能显著抑制KAP-1的蛋白表达;其中最有效的1条siRNA包装成重组慢病毒Lv-siRNA-KAP-1,感染PANC-1细胞侵袭能力明显受到抑制;感染后细胞侵袭数目(97.3±25.6)较空白对照组(253.3±20.6)与阴性对照组(213.2±19.4)明显减少,差异显著(P<0.05);感染后PANC-1细胞的波形蛋白表达下调.结论:Lv-siRNA-KAP-1能显著抑制PANC-1细胞KAP-1的表达,抑制PANC-1细胞侵袭能力及波形蛋白表达,KAP-1基因有可能成为胰腺癌基因治疗的新靶点.
- 江建新詹磊黄洋何燕浙孙诚谊
- 关键词：胰腺癌小干扰RNA
- KAP-1在胰腺癌中的表达及临床意义被引量：1
- 2013年
- 目的:研究KAP-1在胰腺癌组织和细胞株中的表达及意义.方法:采用免疫组织化学方法检测46例胰腺癌标本(高分化15例,中分化17例,低分化14例)及9例正常胰腺标本中的KAP-1表达;采用RT-qPCR和Western blot的方法检测8对胰腺癌组织和配对癌旁组织标本中KAP-1的mRNA和蛋白质水平;采用RT-qPCR和Wsetern blot检测胰腺癌细胞株BxPC3、PANC-1、AsPC-1、SW1990、MIAPaCa-2、CFPAC-1、Capan-1和Capan-2中KAP-1mRNA和蛋白的表达水平.结果:免疫组织化学结果显示KAP-1在胰腺癌组织中阳性表达率为45.6%(21/46例),正常胰腺组织中阳性表达率为11.1%(1/9);在低分化胰腺癌组织中阳性表达率为78.6%(11/14),中分化胰腺癌组织为47.1%(8/17),高分化胰腺癌组织为13.3%(2/15);RT-qPCR和Western blot显示在胰腺癌组织中KAP-1的mRNA和蛋白质水平较癌旁正常胰腺组织高,KAP-1的mRNA水平在Panc-1中最高,在BXPC-3和CFPAC-1中较高,在SW1990、Capan-1和MIAPaCa-2中较低,在AsPC-1和Capan-2中最低.KAP-1蛋白质水平在低分化胰腺癌细胞株MIAPaCa-2和Panc-1中高,来源于肝转移的胰腺癌细胞系CFPAC-1中较高,其余细胞株中不表达.结论:KAP-1在胰腺癌组织中高表达,正常胰腺组织中几乎不表达,其表达与胰腺癌细胞分化相关;KAP-1可能在胰腺癌发生发展中发挥重要作用.
- 江建新詹磊黄洋何燕浙孙诚谊
- 关键词：胰腺癌分化
- 慢病毒介导KAP-1增强胰腺癌细胞Capan-2侵袭能力
- 2013年
- 目的观察KAP-1基因对人胰腺癌细胞Capan-2侵袭能力的影响,探求该基因作为治疗靶点的可行性。方法针对KAP-1基因构建真核表达载体,在293T细胞中包装成重组慢病毒Lv-eGFP-KAP-1,RT-qPCR和Western Blot法检测其对Capan-2细胞KAP-1的影响,Transwell侵袭小室检测其对Capan-2细胞侵袭能力的影响。结果成功地构建Lv-eGFP-KAP-1,感染Capan-2后细胞侵袭数目(128.3±4.6)较空白对照组(45.3±2.6)与阴性对照组(36.2±3.4)明显增加,差异有显著性(P<0.05)。结论 Lv-eGFP-KAP-1能显著上调Capan-2细胞KAP-1的表达,增强其侵袭能力,KAP-1基因有可能成为胰腺癌基因治疗的新靶点。
- 江建新詹磊黄洋何燕浙喻超孙诚谊
- 关键词：胰腺癌细胞侵袭
- 影响胰腺癌预后因素的分析被引量：3
- 2014年
- 目的 综合分析和评价临床病理特点和治疗方式对胰腺癌患者预后的影响.方法 选取2004年1月至2007年1月,由贵阳医学院附属医院肝胆外科收治的胰腺癌患者作为本课题研究对象,选择其中临床资料齐全并且获得成功随访的91例患者,对有可能影响预后的临床病理因素（包括临床病理特点和治疗方式）进行单因素Kruskal-Wallis法和多因素Cox比例风险模型的统计学分析处理,用Kaplan-Meier方法计算生存率,评价因素对临床预后的影响.结果 可能影响胰腺癌患者预后的临床病理因素包括：年龄、性别、肿瘤部位、病理类型、胰周侵犯（包括周围血管、淋巴结、邻近脏器）、远处转移（包括肝转移）、临床分期和治疗方式.单因素分析表明：胰周侵犯、远处转移、临床分期、治疗方式与胰腺癌预后密切相关（P＆lt;0.05）;而年龄、性别、肿瘤部位、病理类型与预后关系不密切（P＆gt;0.05）.再对筛选出来的有统计学意义的临床病理因素,应用多因素分析表明：胰周侵犯是影响胰腺癌患者预后的首位独立因素.肿瘤临床分期（TNM）Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅴ期患者的1年生存率分别为80.65%、74.29%、26.32%、25.00%,5年生存率分别为16.31%、5.71%、0、0.根治手术组（包括胰十二指肠切除术、胰体尾切除术）、姑息手术组（包括单纯胆囊空肠吻合术、胆总管空肠Roux-en-Y吻合术、胆肠吻合加胃肠吻合术、十二指肠镜下胆道内支架植入术）1年生存率分别为77.42%、23.08%,5年生存率分别为9.22%、0.结论 胰周侵犯是影响胰腺癌患者预后的首位独立因素.早期确诊并进行根治性手术切除是提高胰腺癌患者生存率的最有效方法.对不能行根治性手术的胰腺癌患者应根据其个体情况选择不同类型的姑息手术方式治疗.
- 潘耀振孙诚谊张浩詹磊田舍张宏
- 关键词：胰腺肿瘤预后病理因素
- 微创保胆取石术联合牛磺熊去氧胆酸与腹腔镜胆囊切除术治疗胆囊结石的对比研究被引量：24
- 2014年
- 目的探讨微创保胆取石术联合牛磺熊去氧胆酸与腹腔镜胆囊切除术治疗胆囊结石的疗效。方法统计贵阳医学院附属医院2011年5月至2012年5月收治的微创保胆取石治疗胆结石患者100例和腹腔镜胆囊切除治疗胆结石患者173例,保胆患者作为治疗组术后均口服牛磺熊去氧胆酸,胆囊切除患者作为对照组术后给予常规抗炎支持治疗,所有患者术后平均随访时间为1年,统计各组患者胆石症状改善情况和治疗组患者的胆囊壁厚、胆囊功能水平和结石复发率。结果治疗组患者手术前胆绞痛、腹胀、右上腹不适发生率分别为47.1%、21.8%、100%,胆囊壁厚为(3.42±0.49)mm,手术后1年胆绞痛、腹胀、右上腹不适发生率分别为2.3%、9.2%、2.3%,胆囊壁厚为(2.57±0.69)mm;胆囊结石患者组胆囊排空指数为43.11±20.82,保胆取石术后两年患者组胆囊排空指数为56.00±10.77,正常组胆囊排空指数为56.65±13.45,患者手术前后胆石症状、胆囊壁厚的差异均具有统计学意义(P<0.05),保胆取石术后两年患者组胆囊排空指数与正常组差异无统计学意义(P>0.05),而与胆囊结石组患者组差异有统计学意义(P<0.05);术后1年治疗组患者腹泻、腹胀、右上腹不适症状发生率分别为2.3%、9.2%、2.3%,对照组患者腹泻、腹胀、右上腹不适症状发生率分别为33.6%、25.5%、17.3%,两组之间胆石症状的差异均具有统计学意义(P<0.05),治疗组患者术后胆固醇结石复发率有降低趋势。结论保胆取石术后口服牛磺熊去氧胆酸对术后患者胆囊功能的恢复及预防胆囊胆固醇结石的复发有重要意义。
- 张宏潘耀振张浩詹磊孙诚谊
- 关键词：保胆取石术胆囊结石病牛磺熊去氧胆酸
- shRNA干扰KAP-1基因表达对胰腺癌肿瘤干细胞自我更新的影响被引量：3
- 2013年
- 目的研究KAP-1对胰腺癌肿瘤干细胞自我更新能力的影响。方法采用免疫组织化学方法检测14例胰腺癌组织标本和配对癌旁组织标本KAP1蛋白的表达情况。PCR扩增KAP1shRNA干扰序列，克隆至pGC—LV慢病毒表达载体；双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测。构建成功后感染人胰腺癌细胞株Panc-1细胞48h后，通过Westernblot实验和RT—qPCR实验检测KAP-1的表达量以及该细胞系相关EMT标志蛋白波形蛋白的表达。采用悬浮法培养人胰腺癌Panc-1细胞生成肿瘤干细胞球，通过测定初代以及次代肿瘤干细胞球的成球直径和数量判断KAP1基因敲减对肿瘤干细胞球成球能力及自我更新能力的影响。结果在14例胰腺癌组织标本和癌旁组织标本的免疫组织化学检测中，胰腺癌组织标本KAP1阳性数为13例（P=0．002）。构建的慢病毒载体感染细胞48h后，在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光。RTqPCR实验显示感染KAP-1RNA干扰慢病毒载体的Panc-1细胞KAP-1及EMT标志蛋白波形蛋白的表达量较未感染病毒细胞以及感染空载体细胞显著增高。KAP1基因敲低表达的人胰腺癌Panc-1肿瘤干细胞球的初代以及次代的成球直径相较于转染空载体的Panc1肿瘤干细胞球发生明显减小，在成球数量上也明显减少。结论KAP-1在胰腺癌组织中存在表达，且与正常组织表达量具有明显差异。构建了高效稳定表达KAP-1的RNA干扰慢病毒转染系统。KAP1转录因子表达量降低可以减弱人类胰腺癌细胞Panc-1细胞系生成干细胞球的自我更新能力。其机制可能与敲低KAP-1表达影响波形蛋白下调有关。
- 江建新詹磊潘耀振孙诚谊
- 关键词：胰腺肿瘤干细胞基因表达
- MUC1黏蛋白启动子的克隆及在胰腺癌Panc-1细胞中的转录活性
- 2014年
- 目的 克隆MUC1黏蛋白启动子,研究MUC1启动子在人类胰腺癌细胞株Panc-1细胞和人类宫颈癌细胞株Hela细胞中的转录活性.方法 采用巢式PCR扩增MUC1启动子片段并酶切连接至含有EGFP报告基因的pEGFP-N1载体中构建质粒pEGFP-MUC1-N1,采用基因重组方法将MUC1启动子片段及EGFP报告基因构建于pShuttle质粒上形成pShuttle-MUC1-EGFP质粒.通过脂质体共转染人胰腺癌细胞株Panc-1和人宫颈癌细胞株Hela.使用荧光素酶检测系统（Luciferase assay system）测定细胞的荧光素酶活性,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测MUC1启动子在Panc-1细胞中的特异转录活性.结果 成功克隆出MUC1启动子,双酶切、PCR检测和DNA测序证实pEGFPMUC1-N1、pShuttle-MUC1-EGFP载体构建成功.重组报告载体荧光素酶活性显著升高（t=18.975,P =0.001）.经pEGFPMUC1-N1、pShuttleMUC 1-EGFP质粒转染后MUC1启动子在Panc-1细胞中的转录活性为阳性对照CMV启动子活性的69.6％及63.6％,明显高于Hela细胞中的4.2％及3.7％,在胰腺癌细胞中具有较高特异性,且在胰腺癌细胞中的活性明显高于阴性对照pGL3-Basic的0.093％.结论 MUC1启动子在淋巴瘤细胞中具有较高的特异性,可以作为胰腺癌细胞基因转染的肿瘤特异性启动子使用.此研究为进一步运用MUC1启动子在基因水平靶向治疗胰腺癌奠定了基础.
- 潘耀振孙诚谊詹磊张浩田舍张宏姜楠
- 关键词：胰腺癌
