魏旭东
- 作品数：5 被引量：8H指数：2
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 骨骼肌高表达质粒VR/TPO在CHO细胞中瞬时表达及动物实验被引量：1
- 2000年
- 构建肌肉高表达质粒VR/TPO ,将其在体外定量表达 ,并初步了解其体内表达活性。方法 :以重组TPOcDNA为目的基因 ,构建人VR/TPO高效表达质粒 ,用脂质体法将其转染CHO细胞 ,RT PCR法检测mRNA表达 ,ELISA法检测TPO的表达量 ,并注入体内了解其对巨核系造血的影响。结果 :VR/TPO可在CHO中高效表达 ,其表达量超过 pcDNA3TPO ,并初步发现有促进血小板增加作用。 结论 :VR/TPO为一高效表达TPO质粒 ,在体内外都有一定表达活性。
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- 关键词：血小板生成素基因转移CHO细胞
- 电脉冲介导的Tpo基因转移对正常及实验性血小板减少小鼠的促血小板生成作用
- 2001年
- 目的 应用电脉冲介导的重组人血小板生成素 (rhTpo)基因的体内转移 ,探讨其对正常及实验性血小板减少小鼠的促血小板生成作用。方法 应用基因重组技术 ,构建真核细胞高表达质粒pcDI Tpo ,将 2 0 0 μgpcDI Tpo质粒注入正常及实验性血小板减少小鼠的股四头肌内 ,随后给予 10 0V、1Hz、40ms电刺激 6次 ,用RT PCR及Westernblot方法观察rhTpo基因在正常小鼠骨骼肌内的表达 ,ELISA法测定小鼠血浆Tpo水平。用细胞计数板计数小鼠外周血血小板。结果 成功构建了真核细胞高表达质粒pcDI Tpo。将pcDI Tpo转染小鼠后 ,在小鼠的骨骼肌内有rhTpomRNA及蛋白的表达 ,血浆Tpo水平由 (2 5 0± 76 )ng L升高至 (1185± 2 6 4)ng L。正常小鼠的外周血血小板由 (2 5 9± 2 7)× 10 9 L最高升高至 (6 40± 31)× 10 9 L ;注射卡铂后 ,转pcDI Tpo组小鼠的血小板最低下降至 (138± 2 4)× 10 9 L ,比转pcDI空载体组 [(98± 19)× 10 9 L]和单纯注射卡铂组 [(92± 16 )× 10 9 L]最低值高 ,同时血小板恢复时间提前 ,第 14天已恢复至 (2 38± 2 6 )× 10 9 L。结论 应用电脉冲介导的基因转移方法 ,可使rhTpo基因在小鼠骨骼肌内有效地表达 。
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- 关键词：血小板减少基因表达
- RevTet-On系统调控血小板生成素基因表达的研究被引量：2
- 2000年
- 本研究应用RevTet On基因表达系统 ,通过四环素衍生物强力霉素 (doxcycline ,Dox)调控血小板生成素 (TPO)基因在NIH3T3细胞中的表达。首先应用基因重组技术构建含TPO基因的重组质粒 pRevTRE/TPO ,然后将RevTet On基因调控系统的pRevTet On和 pRevTRE/TPO分别转染PT67细胞 ,从而包装RevTet On和RevTRE/TPO重组逆转录病毒 ,同时将此两种病毒感染NIH3T3细胞 ,建立整合入RevTet On和RevTRE/TPO逆转录病毒的阳性细胞株 (RevTet On3T3/TPO)。通过Dox调节TPO基因在此细胞株中表达 ,培养基中加入 2mg/LDox或不加Dox ,然后用RT PCR ,Western印迹和ELISA方法检测TPO基因表达情况。结果发现 ,RevTet On3T3/TPO当培养基中不加Dox时用RT PCR和Western印迹检测未见TPO表达 ,用ELISA检测表达TPO量低 ;在培养基中加入Dox时 ,RT PCR和Western印迹检测可见TPO表达 ,且TPO表达量高 ,为不加Dox时的 91倍。本实验表明 ,通过建立逆转录病毒整合的NIH3T3细胞株 ,利用四环素及其衍生物Dox调节TPO基因的表达 。
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- 关键词：血小板生成素基因表达NIH3T3细胞
- 重组人血小板生成素基因在COS-7细胞及在小鼠体内的转移与表达
- 2001年
- 为了观察重组血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)基因在COS 7细胞及在小鼠体内的表达 ,应用DNA重组技术构建了含TPO基因的真核表达质粒 pcd2 TPO ,用脂质体法将其转染COS 7细胞 ,用裸质粒DNA直接注射加电脉冲的方法将 pcd2 TPO质粒转移到小鼠骨骼肌中。用RT PCR及ELISA法检测到TPO基因在COS 7细胞的瞬时表达 ,MTT法显示其有刺激TPO依赖细胞系增殖的活性。RT PCR及免疫组织化学染色可检测到TPO基因在转基因小鼠骨骼肌的表达 ,ELISA法定量检测转基因组小鼠血清TPO浓度为 (1185± 2 64)ng L ,明显高于正常小鼠的TPO浓度 (2 5 0± 76)ng L。本实验实现了TPO基因在小鼠体内和COS 7细胞的转移 。
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- 关键词：血小板生成素COS-7细胞基因转移基因表达
- 促血小板生成素基因在NIH3T3细胞中表达的定量调节被引量：7
- 2000年
- 目的 应用逆转录病毒载体四环素调控系统 ,定量调节促血小板生成素 (TPO)基因在NIH3T3细胞中的表达。方法 pRevTet On质粒转染逆转录病毒包装细胞PT6 7细胞 ,应用包装成Tet On重组逆转录病毒 ,并将此病毒感染NIH3T3细胞 ,建立整合入Tet On逆转录病毒的阳性细胞株(RevTet On3T3) ,并通过强力霉素调控荧光素酶基因的表达证明此细胞株具有调控作用。构建pRevTRETPO重组质粒 ,转染PT6 7细胞 ,包装成含四环素反应元件和血小板生成素基因的重组逆转录病毒。再将此病毒感染上述细胞株 ,建立整和双病毒的细胞株 (RevTet On3T3TPO) ,通过强力霉素调节TPO基因在此细胞株中表达。培养基中加入 5mg·L-1强力霉素 (Dox)或不加Dox ,培养 72h后检测促血小板生成素基因表达情况。结果 RevTet On3T3在培养基中加入Dox时荧光素酶活性高 ,平均为5 .9× 10 4 RLU·S ,当培养基中不加Dox时荧光素酶活性低 ,平均为 2 .6× 10 3RLU·S。RevTet On3T3TPO在培养基中加入Dox时TPO表达量高 ,平均为 12 .8ng/ml。在培养基中不加入Dox时TPO表达量低 ,平均为 0 .5 6ng/ml,加Dox组为不加Dox组的 2 2 8倍。结论 建立逆转录病毒整合的NIH3T3细胞株 ,可利用四环素及其衍生物定时、定量调节多种外源基因的表达 ,增加基因治疗的精确性和?
- 魏旭东伏爽武莎莎王申五王德炳
- 关键词：血小板生成素荧光素酶基因表达NIH3T3细胞
