熊向华
- 作品数：76 被引量：129H指数：6
- 供职机构：北京生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 通过转座诱变筛选甲基营养菌吡咯喹啉醌合成缺陷突变株被引量：2
- 2014年
- 目的:对电转化等Tn5转座诱变条件进行优化,获得大量甲基营养菌MP688突变株,筛选吡咯喹啉醌(PQQ)合成缺陷突变株,并对失活基因进行鉴定。方法:通过电击方法对MP688株进行Tn5转座诱变;通过检测PQQ产量,选择不产或几乎不产PQQ的突变株,用质粒拯救的方法鉴定突变基因。结果和结论:确定了MP688株电击转化的最优条件,优化了质粒拯救法鉴定突变基因的实验方案,得到了1株PQQ合成明显降低的突变株RM16,并确定了转座子在染色体上的插入位点。
- 韩月梅葛欣王鹤熊向华汪建华刘党生张惟材
- 关键词：甲基营养菌吡咯喹啉醌电击转化突变
- 甲基营养菌MP688甲醇脱氢酶基因mpq1818的敲除及功能研究被引量：6
- 2014年
- 目的:研究甲醇脱氢酶基因mpq1818在甲基营养菌MP688生长代谢中的作用。方法:利用同源重组原理构建中间为庆大霉素抗性基因Gmr、两侧mpq1818基因上下游序列同源的敲除载体pAK0-up-Gmr-down,接合转移导入MP688,通过庆大霉素抗性和组合PCR方法筛选基因敲除菌,并检测其生长、甲醇脱氢酶活性、甲醇利用及吡咯喹啉醌(PQQ)生物合成能力等方面的差异。结果:抗性和PCR验证显示mpq1818缺失株构建成功;与野生菌相比,缺失株的甲醇脱氢酶活力及利用甲醇的能力降低,而且菌株的生长和PQQ产量也有显著下降。结论:基因mpq1818的缺失影响菌株前期生长与PQQ合成。
- 李大攀葛欣魏静远熊向华汪建华杨秀萍张惟材
- 关键词：甲基营养菌甲醇脱氢酶基因敲除吡咯喹啉醌
- 高比活人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达
- 2005年
- 人睫状神经营养因子(hCNTF)及其突变体有望成为治疗肥胖症的新型药物。为了减少hCNTF的副反应,提高其疗效,在hCNTF四重突变体AX15 (R13K)的基础上引入S16 5D Q16 6H突变,构建了高比活的DH_AX15 (R13K)突变体。体外和体内实验表明DH_AX15 (R13K)的活性约是AX15 (R13K)的5倍。同时体内实验还发现DH_AX15(R13K)的作用比AX15 (R13K)更为持久。这种更为持久的作用可能是由于活性提高而非半衰期延长引起的。高比活的hCNTF突变体一方面可以在保证疗效的前提下减少蛋白用量,减少副反应;另一方面可以在不增加副反应的前提下增加最大耐受剂量,提高疗效。
- 赵洪亮薛冲熊向华张伟刘志敏
- 关键词：睫状神经营养因子巴斯德毕赤酵母
- 酮古龙酸菌山梨酮脱氢酶的原核表达及活性鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的:克隆酮古龙酸菌Y25的山梨酮脱氢酶基因sndh2,在大肠杆菌中进行表达,并检测表达产物的活性。方法:以酮古龙酸菌Y25基因组DNA为模板,PCR扩增sndh2基因,连接到pET22b表达载体后转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达;对菌体裂解液进行SDS-PAGE分析;以D-木糖为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后活性染色及DCIP检测法鉴定表达产物的脱氢酶活性。结果:扩增得到1290 bp的山梨酮脱氢酶基因;构建了表达质粒pET22b-sndh2,SDS-PAGE结果显示获得相对分子质量为43.1×103的可溶性表达产物;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上出现的蓝黑色条带及DCIP检测液颜色的变化说明表达产物在以D-木糖为底物时表现出脱氢酶活性。结论:在大肠杆菌中表达的山梨酮脱氢酶具有生物活性。
- 张谷青陈微微熊向华汪建华游松张惟材
- 关键词：原核表达活性电泳生物活性
- 山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶及其应用
- 本发明提供氧化葡糖杆菌CGMCC No.1.637的山梨糖脱氢酶和山梨酮脱氢酶，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.2和4所示。本发明还提供编码上述蛋白的基因或基因簇。本发明将带自身调控序列的SNDH-SDH基因簇连入...
- 张惟材熊向华汪建华葛欣陈微微侯伟
- 文献传递
- 生长激素释放激素和人血清白蛋白融合蛋白的克隆表达被引量：4
- 2007年
- 目的:通过与人血清白蛋白(HSA)融合,延长生长激素释放激素(GHRH)在体内的半衰期。方法:根据毕赤酵母偏爱密码子重新设计GHRH的核酸序列,并通过化学合成和重叠PCR法将GHRH的N端与HSA的C端通过一个11肽的接头连接,获得GHRH和HSA融合的全长基因序列。构建pPIC9-HSA-GHRH表达载体,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果:克隆了HSA-GHRH融合基因,构建了pPIC9-HSA-GHRH融合表达载体;电击转化后通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌;经分离纯化后,对表达产物的生物学活性分析显示其在体内有促进生长的作用。结论:与人血清白蛋白的融合有效地提高了GHRH的表达水平,并延长了GHRH的半衰期。
- 王楠赵洪亮刘志敏刘党生薛冲熊向华
- 关键词：生长激素释放激素人血清白蛋白毕赤酵母生物学活性
- 2种太岁样品中微生物的分离和鉴定被引量：16
- 2013年
- 目的:太岁是自然界中一种组成及分类尚不明确的生物体。采用分子生物学方法对2种不同来源地的太岁样品进行菌种分离培养和分子鉴定。方法:太岁表面经75%乙醇消毒处理后,用麦芽汁培养基分离可培养菌株,提取太岁及分离菌株基因组DNA,以之为模板,用16S rDNA、18S rDNA和ITS通用引物进行PCR扩增,扩增片段连入pMD18T载体并测序,通过序列比对对太岁菌种组成进行初步鉴定。结果:从太岁1号样品中分离到假丝酵母(Can?dida)和粘质红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),从太岁2号样品中分离到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和粘质红酵母。结论:2种来源不同的太岁样品中均存在可培养的粘质红酵母。
- 林涧熊向华葛欣汪建华苏昕张惟材
- 关键词：生物多样性分子鉴定
- 酮古龙酸菌醇醛脱氢酶基因的克隆及表达被引量：2
- 2009年
- 目的:从酮古龙酸菌SCB329株中分离山梨糖生物氧化相关酶的基因并进行表达验证。方法:根据酮古龙酸菌SCB329株基因组序列设计引物,通过PCR从SCB329株基因组中扩增醇醛脱氢酶基因aadh;构建载体pBMP3-aadh并在大肠杆菌中表达,经活性染色、体外转化反应等方法考察表达产物的活性。结果:目的产物能够催化山梨糖、葡萄糖、果糖、木糖等多种含羟基及羰基化合物脱氢,并能将L-山梨糖直接转化为2-酮基-L-古龙酸。结论:从酮古龙酸菌SCB329株中分离到一种醇醛脱氢酶基因,可为该菌株糖酸转化机制的研究提供帮助。
- 姜泽慧熊向华张惟材何建勇汪建华
- 关键词：活性染色
- 酮古龙酸菌细胞色素c的表达、成熟及活性分析被引量：1
- 2011年
- 目的:从酮古龙酸菌Y25中扩增细胞色素c基因,在大肠杆菌中表达、成熟并进行生物活性分析。方法:从酮古龙酸菌Y25基因组中PCR扩增细胞色素c基因,构建pET22b表达载体;从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增细胞色素c成熟基因簇ccmABCDEFGH,连接到带有山梨糖脱氢酶组成型启动子的pBBR1MCS2-P200载体中;将构建的2个质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行血红素染色检测;通过氧化还原光谱法对Ni柱亲和纯化的重组蛋白进行活性分析。结果:扩增得到1404 bp的细胞色素c基因及6481 bp的ccmABCDEFGH基因簇;重组菌株经IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析,可见相对分子质量为50×103的表达条带;血红素染色显示重组蛋白结合有血红素;经氧化还原光谱扫描,显示亲和层析纯化得到的目的蛋白有细胞色素c特征吸收峰。结论:从酮古龙酸菌Y25中扩增得到了细胞色素c基因,在大肠杆菌中进行了表达和成熟,表达蛋白具有细胞色素c生物活性。
- 程红熊向华赵岩汪建华张怡轩张惟材
- 关键词：细胞色素C电子传递
- 甲基营养菌MP688基因组完成图构建
- 2011年
- 目的:在Solexa测序建立的甲基营养菌MP688基因组精细图的基础上,构建MP688基因组完成图。方法:根据MP688基因组序列设计引物,进行常规PCR扩增,填补Scaffold内部缺口;利用BLASTN、BLAT软件分析预测6个Scaffold定位关系;通过组合PCR、长距离PCR等填充Scaffold间的物理缺口。结果:常规PCR填充Scaffold内部4个缺口;BLASTN、BLAT软件分析预测了Scaffold定位关系;组合PCR填充Scaffold间的2个物理缺口,长距离PCR填充其余4个物理缺口。结论:得到了MP688的基因组完成图,为MP688的吡咯喹啉醌生物合成途径的阐明和进一步的代谢工程育种奠定了基础。
- 智静娟熊向华何建勇汪建华何涛张惟材
- 关键词：甲基营养菌
