黄毕
- 作品数：13 被引量：9H指数：2
- 供职机构：四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金教育部科学技术研究重点项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体的构建及在COS7细胞中融合表达的研究
- 2009年
- 从赖型钩端螺旋体017株全基因组中通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)分别扩增出脂蛋白32(LipL32)和溶血素-X(HlyX)基因,应用重叠延伸PCR技术(Gene splicing by overlap extension PCR,SOEPCR)获得LipL32-HlyX融合基因。以pcDNA3.1为载体,LipL32-HlyX为目的基因,双酶切构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经双酶切、PCR及测序鉴定证实重组质粒构建成功。脂质体转染法将构建成功的重组质粒转染COS7细胞,RT-PCR扩增出约2000bp的目的基因,Western blotting分析发现在75KD处出现特异性的阳性条带。结果证实赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体能在哺乳动物细胞中表达,为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础。
- 黄毕鲍朗钟琪张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达
- ompL17基因酵母双杂交系统的构建及筛选鉴定被引量：3
- 2008年
- 目的寻找钩体致病的信号传导通路,分析ompl17基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白。方法分别构建诱饵质粒载体和血管内皮细胞cDNA文库,通过顺序性转染转入酵母细胞中,然后进行初步的鉴定。结果PCR和酶切分析证实构建成功了诱饵质粒载体和血管内皮细胞cDNA文库。结论成功构建酵母双杂交系统为发现ompl17基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白奠定了基础。
- 张会东郝牧鲍朗黄毕高蕾
- 关键词：钩端螺旋体克隆
- 赖型钩体毒力相关基因OmpL17表达纯化及其产物的趋化作用
- 2008年
- 目的研究钩体017株外膜蛋白新基因ompl17与钩体肺大出血的相关性。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出ompL17基因,与表达载体pGEX-4T-1重组,诱导表达OMPL17蛋白,然后纯化得到活性表达产物,并建血管基底膜,分析该产物的趋化活性。结果SDS-PAGE和Western-blot分析证实诱导表达并纯化得到OMPL17蛋白,趋化作用分析证明该基因表达产物具有趋化活性。结论成功表达纯化出ompL17基因的蛋白,观察到该基因表达产物具有趋化活性,为赖型钩体的分子机制的进一步阐明奠定了基础。
- 张会东郝牧鲍朗黄毕高蕾
- 关键词：钩端螺旋体趋化
- 赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究
- 2008年
- 目的构建赖型钩端螺旋体(钩体)017株外膜蛋白LipL32基因的重组质粒,并研究其细胞毒性。方法从钩体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌,诱导表达LipL32蛋白,将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western Blotting鉴定其免疫原性。将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、NO释放量研究其细胞毒性。结果扩增出816bp的LipL32基因,重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约52×103,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物制备得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1:32000,Western Blotting显示在目的蛋白位置处有特异性阳性条带。经过LipL32蛋白作用的ECV304细胞LDH、NO释放量和对照组比较有明显升高。结论成功构建LipL32基因重组质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有一定的毒性效应。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东王中平
- 关键词：钩端螺旋体外膜蛋白LIPL32细胞毒性
- 赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用被引量：3
- 2008年
- 目的对赖型钩端螺旋体Loa22基因进行表达和功能研究。方法构建赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽重组质粒,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目标蛋白表达情况。经亲和层析获得目标蛋白并作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、四氮唑复合物(XTT)吸光度值和细胞凋亡率以评价其细胞毒性。结果成功构建Loa22成熟肽原核表达质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽,该蛋白使培养ANA-1细胞上清液中LDH活力升高,XTT吸光度值下降,细胞凋亡率增加。结论Loa22对ANA-1具有明显的毒性效性,该基因可能是致病钩体的一个重要毒力相关基因。
- 张英鲍朗朱海龙黄毕章乐张会东
- 关键词：钩端螺旋体巨噬细胞细胞毒性
- 结核分枝杆菌毒力分泌系统Rv3871基因的分子克隆及蛋白表达研究被引量：1
- 2008年
- 目的为探索参与结核分枝杆菌(MTB)毒力分泌系统相关基因的分子功能,对MTB H37Rv株编码Rv3871蛋白基因进行克隆、表达及鉴定分析。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,用PCR扩增Rv3871基因片段,并重组到原核表达载体pET32a(+)中,转化E.coliBL21(DE3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测分析。结果阳性重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到1 776和5 900 bp两条片段,与预期大小一致。重组质粒测序,与NCBI上Rv3871编码序列比对完全一致,且输入片段读码框与表达载体读码框相吻合。SDS-PAGE检测表达蛋白分子质量单位为84 ku;Western blot检测出特异性阳性信号。结论本研究成功构建了结核杆菌毒力分泌系统重要相关基因Rv3871的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达Rv3871蛋白,为进一步探讨该基因在MTB毒力分泌中的功能奠定了基础。
- 秦紫芳邱云青黄毕高蕾鲍朗
- 关键词：蛋白表达
- 结核杆菌Rv0901基因真核表达质粒的构建及在细胞内的表达与鉴定(英文)
- 2007年
- 目的构建结核杆菌Rv0901基因的真核表达质粒并进行表达,为研究Rv0901基因的功能提供材料。方法以结核杆菌基因组DNA为模板PCR扩增Rv0901基因序列,将Rv0901基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)获得重组表达质粒,体外转染Cos7细胞,RT-PCR检测转染的情况,并提取转染细胞总蛋白和收集细胞培养液上清检测蛋白的表达,Western-blotting检测蛋白表达的特异性。结果成功扩增出Rv0901基因序列,成功构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-Rv0901,重组质粒转染细胞后的RT-PCR能扩增出Rv0901基因序列,转染细胞总蛋白和细胞培养液上清均能特异表达Rv0901基因蛋白。结论成功构建Rv0901基因真核表达质粒并在真核细胞内进行了良好表达,为研究该基因功能打下了坚实基础。
- 钟琪鲍朗黄毕商正玲姚素霞刘鱼
- 关键词：结核杆菌脂质体转染真核表达
- 赖型钩体毒力相关基因ompL17的重组表达以及体外不同温度下的表达研究
- 2008年
- 目的:观察ompL17基因表达产物的免疫原性以及该表达蛋白在动物模型中的分布情况。方法:提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出ompL17基因,与表达载体pGEX-4T-1重组,诱导表达OMPL17蛋白,分析该基因在017株中体外不同温度的表达情况。结果:PCR和酶切分析证实构建成功了表达载体,SDS-PAGE分析证实诱导表达出OmpL17蛋白;体外不同温度下发现该基因不表达蛋白。结论:成功表达出ompL17基因的蛋白,体外不同温度未发现该蛋白的表达,为赖型钩体的分子机制的阐明奠定了基础。
- 张会东郝牧鲍朗黄毕高蕾
- 关键词：钩端螺旋体克隆
- 小鼠巨噬细胞转染Rv0901基因后活性的改变
- 2007年
- 目的将重组结核分枝杆菌Rv0901基因的重组质粒pcDNA3.1-Rv0901转染小鼠腹腔巨噬细胞,研究结核分枝杆菌Rv0901基因在结核分枝杆菌感染巨噬细胞的过程中所起的作用。方法制备小鼠腹腔巨噬细胞,分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rv0901质粒DNA与绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA混合,以脂质体转染的方式共转染小鼠腹腔巨噬细胞。转染后72h,分别收集细胞用流式细胞仪检测GFP的表达和细胞凋亡的发生情况,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测质粒的转染情况。收集转染72h后的细胞培养液上清,检测细胞NO、IFN-γ的释放水平。结果pcDNA3.1和pcDNA3.1-Rv0901转染的巨噬细胞中均检测到了GFP的表达,转染后的巨噬细胞RT-PCR能扩增出Rv0901的目的片段,pcDNA3.1-Rv0901转染巨噬细胞后细胞的凋亡率高于空载体对照组(56.4±2.0)%vs(19.9±1.5)%,P<0.05,pcDNA3.1-Rv0901转染巨噬细胞后细胞培养液上清中NO和IFN-γ的释放量高于空载体对照组NO:(40.4±3.0)μmol/Lvs(27.5±3.2)μmol/L,IFN-γ:(2.11±0.031)ng/mLvs(0.62±0.025)ng/mL,P均<0.05。结论pcDNA3.1-Rv0901转染小鼠巨噬细胞后使巨噬细胞的凋亡增加,NO和IFN-γ的释放量增加,提示结核分枝杆菌Rv0901基因可能导致巨噬细胞的活性增强,与结核分枝杆菌感染巨噬细胞的机理有关。
- 钟琪鲍朗商正玲刘鱼黄毕姚素霞
- 关键词：结核分枝杆菌转染巨噬细胞
- 赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究
- 2008年
- 目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Westernblot检测目的基因的表达。结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达
