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高效转染人T细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用被引量：4: 2006年; 目的：构建能高效转染人T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统，并与传统的逆转录病毒载体系统做比较。方法：首先在原载体pCMMP-EGFP的基础上，构建携带内部核糖体进入位点（IRES）基因的逆转录病毒载体pCMMP-IRES-GFP。将嵌合T细胞受体基因插入该载体中，与另外两个辅助载体pMD．MLVgag．pol和pHDM．G共同转染包装细胞293T。48h后收培养上清，高速离心病毒。同时将嵌合T细胞受体基因插入传统的逆转录病毒载体pLXSN中，并转染包装细胞PA317，用G418加压筛选出转染的PA317细胞克隆。扩大培养48h后，收细胞培养上清即为病毒液，分别用上述两种方法得到的病，譬液感染NIH333细胞，检测病毒的滴度。取适量病毒液感染川PHA激活后的人原代T细胞，48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光，并用流式细胞术（FCM）检测病毒感染的效率。结果：成功地构建逆转录病毒载体pCMMP—IRES-GFP。将目的基因插入该载体中，与pMD．MLVgag．pol和pHDM．G共同转染包装细胞293T。培养48h后，离心收获浓缩的上清中含有滴度为2．15×10^11VP／L的病毒。以其感染用PHA激活后的人原代T细胞48h后，在荧光显微镜下能观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。FCM检测病毒对T细胞的感染效率为50％～60％，并可用FCM进行分选。而用pLXSN载体转染的PA317细胞，包装得到的病毒滴度为6．43×10^9VP／L，病毒感染T细胞的效率仅为5％～10％。结论：构建了能高效转染T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统，为T细胞的基础与临床研究打下了基础。; 张瑞萍云琳彭玲陆斌周倩王皓郭亚军; 关键词：逆转录病毒载体 T细胞内部核糖体进入位点

Ad.smac腺病毒的构建及其体外抗肿瘤效应的初步研究被引量：3: 2003年; 目的　通过细菌内同源重组 ,制备表达全长smac基因的腺病毒 ,初步观察其体外对肿瘤细胞的杀伤作用。方法　构建含smac基因的腺病毒穿梭载体pAdTrack smac ,与骨架载体 pAdEasy1在细菌内重组为pAd .smac,经 2 93细胞包装为增殖缺陷性腺病毒。体外感染各种肿瘤细胞 ,用苔盼蓝拒染法观察其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果　利用AdEasyTM 系统成功构建了Ad .smac及对照腺病毒Ad .GFP ,多种肿瘤细胞感染Ad .smac后均出现细胞凋亡现象 ,对肿瘤细胞的杀伤率达 30 %以上。结论　利用细菌内质粒同源重组法可快速简捷地制备表达外源基因的腺病毒 ,Ad .smac在体外通过诱导细胞凋亡而有效地杀伤肿瘤细胞 ,为Smac在肿瘤治疗的应用提供了一定的试验参考依据。; 金军赵健张霞张瑞萍石梅李晓东吕岩郭亚军; 关键词：腺病毒体外抗肿瘤效应细胞凋亡

hNa_v1.8通道蛋白在三叉神经痛痛支神经超微结构中的表达及意义: 2005年; 目的:观察三叉神经痛(trigeminal neuralgia, TN)患者痛支神经的有髓纤维脱髓鞘处是否有河豚毒素不敏感型(tetrodo toxin resistant, TTX R)hNav1.8通道蛋白的异常表达,探讨其与三叉神经痛的关系。方法:以6例原发性TN第三支痛经保守治疗无效行手术治疗患者的下牙槽神经为研究对象,以舌颌颈联合根治术患者的耳大神经、下牙槽神经为阴性和正常对照,以鼠脊神经为阳性对照,运用免疫组化的方法观察hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支神经与对照神经标本超微结构中的表达。结果:hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支神经的有髓纤维脱髓鞘处有大量表达,鼠脊神经轴突内有少量表达,而正常下牙槽神经及耳大神经中无表达。结论:hNav1.8通道蛋白在TN患者痛支有髓纤维脱髓鞘处的异常表达可能与TN的发病有关。; 金增强姜晓钟赵云富张瑞萍颜永碧; 关键词：三叉神经痛超微结构免疫组织化学

博莱霉素胸腔灌注治疗肺癌所致胸腔积液的临床观察被引量：5: 2000年; 张瑞萍王庆康; 关键词：肺癌胸腔积液博莱霉素

表达嵌合T细胞受体的T淋巴细胞介导的肿瘤过继性免疫治疗作用机理研究: 有效的抗肿瘤免疫需要机体的免疫系统能够识别肿瘤抗原,并最终利用免疫效应机制清除肿瘤细胞。在人们寻找肿瘤抗原的几十年中,发现大多数的肿瘤抗原是自身抗原,它们异位表达或过表达于肿瘤细胞,能诱导免疫系统产生忽视、克隆清除、和免...; 张瑞萍; 关键词：逆转录病毒免疫突触; 文献传递

HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建被引量：1: 2005年; 目的:通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及pcDNA 3.1(+)-HBx真核表达载体的构建,为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法:用O liga6.0结合P rim er P rem ier 5.0软件设计特异性引物,通过PCR方法从广西HB sA g阳性病人血清中(血清型A drq+)分离得到的病毒株构建的HBxA g质粒中扩增HBx基因。用DNA star5.01和V ector NT I Su ite 8.0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA 3.1(+)质粒中。结果:成功克隆了基因型C型突变型HBx基因,并构建出真核表达载体pcDNA 3.1(+)-HBx。新基因被G eneB ank接受,在G eneB ank上登录号为AY 839630。序列对比和进化树分析表明,新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性(97.8%),2.2%的变异。结论:从广西HB sA g阳性病人病毒株(血清型A drq+)中发现了新的基因型C型突变型HBx基因(m u tan t genotype C)。pcDNA 3.1(+)-HBx真核表达载体的构建,将为进一步研究HBx基因在树实验性肝癌诱发过程中所起的作用打下基础。; 匡志鹏谢裕安梁安民苏建家张瑞萍宋水川王皓; 关键词：肝癌 HBX基因真核表达载体

Smac对骨肉瘤细胞系Saos-2生长及耐药性的影响被引量：1: 2003年; 目的:观察Smac表达对骨肉瘤细胞Saos-2生长和耐药性的影响。方法:构建smac和反义smac表达载体pcDNA-smac 和pcDNA-anti-smac,G418筛选出分别稳定转染pcDNA-smac和pcDNA-anti-smac的骨肉瘤细胞Saos-2。利用流式细胞仪检测各转染细胞的细胞周期分布;绘制各细胞在6 d内的生长曲线以观察各细胞生长情况的变化。同时采用MTT法检测各转染Saos-2细胞对依托泊苷的敏感性。结果:与转染空载体pcDNA3.0的Saos-2细胞相比,转染反义smac的Saos-2细胞G1/G0期比例升高,细胞生长自第4天起明显加快。转染smac的Saos-2细胞的细胞周期及生长曲线无明显差别;依托泊苷作用细胞后,与转染空载体pcDNA3.0的Saos-2细胞相比,转染反义smac的Saos-2细胞的存活率增高;而转染smac的Saos-2细胞的存活率降低。结论:抑制Smac在细胞中表达,可使Saos-2细胞生长加快,增强对依托泊苷的耐受性,Smac在细胞中的过表达可提高Saos-2对依托泊苷的敏感性。; 金军赵健张霞张瑞萍石梅李晓东吕岩郭亚军; 关键词：SMAC 骨肉瘤细胞系 SAOS-2细胞细胞生长耐药性

表达嵌合T细胞受体的T淋巴细胞介导的肿瘤过继性免疫治疗作用研究被引量：3: 2006年; 目的:构建嵌合T细胞受体(chimeric T cell receptor,chTCR),它包括识别肿瘤相关抗原erbB2的单链抗体、共刺激分子CD28和CD3的信号转导链ζ,将其依次克隆入载体pcDNA3中,电转染入人外周血T淋巴细胞,使嵌合T细胞受体在T细胞表面表达,并验证其在体外和体内的抗肿瘤作用,为肿瘤的过继性免疫治疗提供新思路。方法:抗erbB2的单链抗体(由本所保存),人CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段,CD3ζ链的胞内段(分别由RT-PCR的方法获得)依次克隆入载体pcDNA3中,经酶切鉴定正确后,电转染进入人外周血T淋巴细胞,利用流式细胞仪检测T细胞结合Her2蛋白的功能;细胞杀伤试剂金检测T细胞的抗原特异性杀伤功能;并在裸鼠体内验证其对人的乳腺癌细胞株BT-474移植瘤的杀伤效应。结果:成功构建了抗erbB2嵌合T细胞受体并表达在人的T淋巴细胞表面,体外证明能结合Her2肿瘤抗原,并有抗原特异性的杀伤功能,在BALB／c裸鼠体内对表达erbB2的肿瘤细胞BT～474有显著的抑制肿瘤生长的作用。结论:表达嵌合T细胞受体的T淋巴细胞在体外和体内有抗原特异性的杀伤肿瘤的作用,是一种新的肿瘤过继性的免疫治疗策略。; 张瑞萍金增强倪海东彭玲戴建新王皓郭亚军; 关键词：乳腺肿瘤

嵌合T细胞受体的构建及其在T淋巴细胞表面的表达和体外抗肿瘤功能的检测被引量：3: 2006年; 目的利用基因工程技术构建表达嵌合T细胞受体(ch-TCR)分子的逆转录病毒载体(由抗 erbB2的单链抗体和信号传导链CD3ζ组成),感染预先刺激的小鼠T细胞,使得T细胞能以MHC非限制性的方式在体外识别并杀伤肿瘤细胞,为肿瘤的过继性免疫治疗提供新思路。方法将抗erbB2的单链抗体、CD8分子绞链区、CD3ζ链的跨膜区和胞内段依次克隆入逆转录病毒载体pCMMP中,与另外两个辅助载体pHDM．G和pMD．MLVgag．pol共同转染293T细胞,包装获得病毒颗粒,感染NIH3T3细胞检测病毒滴度。取适量病毒液感染预先刺激的小鼠CD3+T细胞,流式细胞仪检测嵌合受体在细胞表面的表达,非放射性的细胞杀伤试剂盒和ELISA检测试剂盒分别检测T细胞的抗原特异性杀伤和细胞因子分泌的功能。结果成功构建抗erbB2嵌合T细胞受体基因的逆转录病毒载体,检测病毒滴度为(2．1±1．1)×108IP／ml。体外感染T淋巴细胞的效率为(45±5)％。体外能杀伤erbB2+的肿瘤细胞SK-BR-3、D2F2／E2,而对erbB2-的肿瘤细胞 MCF-7、D2F2无杀伤功能,并能分泌Th1型细胞因子GM-CSF和IFN-γ。结论表达抗erbB2嵌合T细胞受体的T淋巴细胞体外具有MHC非限制性的、erbB2抗原特异性的杀伤肿瘤细胞和分泌 Th1型细胞因子的功能,为下一步的体内实验打下基础。; 张瑞萍云琳陆斌彭玲周倩王浩郭亚军; 关键词：T细胞受体 T淋巴细胞肿瘤免疫治疗

Smac在TRAIL诱导人骨肉瘤Saos-2细胞凋亡中的作用被引量：2: 2004年; 目的 :初步研究 Smac在 TNF相关的凋亡诱导配体 (TNF- related apoptosis inducing ligand,TRAIL)诱导的人骨肉瘤 Saos- 2细胞凋亡中的作用。方法 :观察细胞形态变化和以琼脂糖凝胶电泳分析 TRAIL 作用的 Saos- 2细胞 DNA片段 ,利用流式细胞术及细胞计数法比较 Smac或 Bcl- 2表达不同的细胞的凋亡程度 ,同时以 Western印迹半定量检测细胞胞质内Sm ac表达水平。结果 :Saos- 2细胞在 TRAIL 的作用下出现典型的凋亡样改变。在 TRAIL 作用 Saos- 2细胞时 ,Smac在胞质中的含量明显增加。在 TRAIL 作用 2 4 h后 ,Smac在 Saos- 2细胞中过表达 ,细胞凋亡率由 1 2 .7%增加到 31 .4 %。TRAIL 作用 Saos- 2细胞 4 8h后 ,转染 Bcl- 2的细胞与转染空载体的 Saos- 2细胞相比 ,凋亡率显著降低 (由 2 4 %降至 1 5 % ) ,且胞质中Sm ac的表达水平也明显降低。结论 :在 TRAIL 诱导的凋亡中 Sm ac起促进作用 ,Bcl- 2可以通过阻止 Sm; 金军赵健李博华张霞张瑞萍李晓东钱卫珠郭亚军; 关键词：SMAC 人骨肉瘤 SAOS-2 细胞凋亡凋亡诱导配体

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张瑞萍

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