周曙光
- 作品数：6 被引量：3H指数：1
- 供职机构：暨南大学医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 稳定表达丙肝病毒EGFP-CORE融合蛋白细胞系的建立
- 2007年
- 目的:构建可表达丙型肝炎病毒(HCV)EGFP-CORE融合蛋白的真核表达载体,获得重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。方法:克隆HCV核心抗原基因于真核表达载体pEGFP-C1中,脂质体法转染QSG7701细胞后,荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP-CORE融合蛋白的表达。再经持续G418压力选择和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。最后用Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果:成功构建真核表达载体pEGFP-C1/CORE;建立了重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系。结论:重组质粒稳定转染的QSG7701细胞系可表达EGFP-CORE,为以CORE基因作为靶位的抗HCV感染研究奠定了基础。
- 李晓栋李君武宋东周曙光王珊黄清华
- 关键词：丙型肝炎病毒绿色荧光蛋白细胞系
- 结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达(英文)
- 2007年
- 背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性。目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。设计:单一样本实验。单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室。材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠。方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成。以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒。再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6。通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达。主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小。②pEGFP-C1DNA序列分析。③转染后Hela细胞的荧光表达情况。④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果。结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7kb,而pEGHsp65为6.4kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异。②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同。③转染融合质粒24h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分�
- 李君武黄泽棋姚翠婵周曙光李晓栋宋东黄清华
- 关键词：结核分枝杆菌HSP65ESAT6融合基因DNA疫苗
- 结核分枝杆菌Hsp65-Esat6与hGM-CSF联合DNA疫苗的构建与体外研究被引量：1
- 2016年
- 目的:应用分子生物学技术,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以p EGHsp65Esat-6为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65-Esat6基因,同时从质粒p ORF-h GM-CSF中扩增出基因佐剂h GM-CSF,分别克隆到真核表达载体p IRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建p IHsp65-Esat6GM共表达质粒,并转染Hep G-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.93 kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65-Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(h GM-CSF)序列与Gen Bank上公布序列完全一致;Western-bolt检测到Hsp65-Esat6融合蛋白相对分子质量(Mr)为75 000 k Da;RT-PCR方法检测出p IGM,p IHsp65GM和p IHsp65-Esat6GM转染组细胞均有h GM-CSF mRNA表达,三组细胞中h GM-CSF基因mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05).ELISA方法检测到p IHsp65-Esat6GM转染组细胞培养上清中h GM-CSF的表达,且与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建和表达了p IHsp65-Esat6GM质粒,为研制优于卡介苗(BCG)的新型抗结核病的DNA疫苗奠定了基础.
- 王森林张梦媛王学坤周曙光江振友
- 关键词：双顺反子基因佐剂
- 结核杆菌Hsp65和hGM-CSF双顺反子表达质粒的构建与表达
- 2007年
- 目的:应用分子生物学技术,构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐剂hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIHsp65GM真核表达质粒,并转染HepG-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致;免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞;ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建和表达了pIHsp65GM质粒,为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.
- 李君武周曙光黄泽棋李晓栋宋东王珊黄清华
- 关键词：结核分枝杆菌双顺反子基因佐剂
- 吉西他滨对人肺癌A549细胞株CN-Ⅱ，APE／Ref-1mRNA和蛋白表达的影响被引量：2
- 2009年
- 【目的】研究人肺癌A549细胞株在吉西他滨化疗时CN-Ⅱ,APE/Ref-1基因表达的变化,并探讨其在肺癌化疗耐药中所起的作用。【方法】不同浓度吉西他滨0、10、20、40及60μmol/L作用人肺癌A549细胞株24h,分别以RT-PCR及Western blot方法测定用药后CN-Ⅱ和APE/Ref-1的mRNA及蛋白表达情况。【结果】吉西他滨作用人肺癌A549细胞株24h后,CN-Ⅱ和APE/Ref-1的mRNA及蛋白表达水平均明显上升,并与吉西他滨的浓度呈正相关(CN-ⅡRT-PCR:r=0.687,P=0.009;Western blot:r=0.594,P=0.021;APE/Ref-1RT-PCR:r=0.669,P=0.010;Western blot:r=0.562,P=0.029)。【结论】CN-Ⅱ和APE/Ref-1在肺癌化疗时表达明显增强,可能与化疗耐药性的产生有关,并提示针对CN-Ⅱ和APE/Ref-1的靶向干预可能有助于提高肺癌的化疗敏感性。
- 宋东周曙光刘玥李晓栋王姗姗唐小龙
- 关键词：吉西他滨APE/REF-1肺癌化疗耐药性
- 结核杆菌Esat6与hGM-CSF双顺反子表达载体的构建及鉴定
- 2007年
- 目的从质粒pVAE中克隆目的基因Esat6,与hGM-CSF一起构建双顺反子表达载体pIEG,并进行鉴定。方法以质粒pVAE为模板扩增出Esat6基因,与pIRES的MCS A进行重组,构建pIEsat6重组质粒。然后再以pORF-hGM-CSF为模板扩增出hGM-CSF基因,与pIRES载体的MCS B进行重组,构建pIGM重组质粒,上述两重组质粒经PCR、限制性内切酶图谱及DNA序列测定分析等多种方法进行鉴定后,再通过酶切、连接把hGM-CSF构建于pIEsat6质粒中,形成双顺反子真核表达载体pIEG。结果通过PCR可克隆得到相应大小的产物,酶切鉴定所切下的两片段大小约为0.29 kb和0.47 kb,与预计相符。测序结果与报道一致。结论成功构建结核杆菌Esat6基因与hGM-CSF双顺反子真核表达载体,为进一步研究其结核融合DNA疫苗及其转染DC疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础。
- 李君武黄泽棋姚翠婵林绍强周曙光李晓栋宋东黄清华王珊
- 关键词：结核分支杆菌ESAT6双顺反子
