国家自然科学基金(31271811)
- 作品数：29 被引量：82H指数：6
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- 双酶体系高效制备(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇被引量：1
- 2016年
- 人工合成经密码子优化的羰基还原酶基因Sys1,并与葡萄糖脱氢酶基因Sygdh共克隆至双启动子表达质粒p ETDuet-1中,获重组质粒p ETDuet-Sygdh-Sys1。将其转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),构建了共表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的重组工程菌E.coli BL21/p ETDuet-Sygdh-Sys1。以经IPTG诱导的重组菌为生物催化剂,不对称还原间-氯苯甲酰甲基氯(m-CPC),制备手性药物中间体(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇((R)-CCE)。在m-CPC 30 mmol/L、重组湿菌体70 mg/m L、葡萄糖40 mmol/L、辅酶NADP+0.2 mmol/L,以及p H 7.0、反应温度40℃和反应时间3 h等条件下,所获手性化合物(R)-CCE的摩尔产率高达99.0%,对映体过量值(e.e.值)为100%。
- 朱利娟余涛顾颖杨标邬敏辰
- 关键词：羰基还原酶葡萄糖脱氢酶共表达
- 新型卤代醇脱卤酶基因的克隆、序列分析及表达被引量：1
- 2015年
- 卤代醇脱卤酶可以催化合成具有光学纯的环氧化物及β-取代醇等高价值手性药物中间体。作者所在实验室利用宏基因组技术从无锡新区工业集中地污染土壤中筛选了一段编码基因Y,经测序知其片段包含有765 bp的核苷酸,编码254个氨基酸。经Blast软件分析,其氨基酸序列与来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的卤代醇脱卤酶Hhe C同源性为81%,且含有卤代醇脱卤酶类的保守催化三联体Ser132-Thr145-Arg149。推测其属于卤代醇脱卤酶Hhe C类,命名为Sy Hhe C。根据大肠杆菌Escherichia coli BL21的密码子偏爱性,对基因Y进行密码子优化和人工合成,命名为Syhhe C,构建重组表达质粒p ET28a-Syhhe C,转化感受态E.coli BL21,表达产物经镍柱亲和层析后获得电泳纯的重组卤代醇脱卤酶re Sy Hhe C。SDS-PAGE分析,re Sy Hhe C的相对分子质量为34 000。以2-溴-1-(4-硝基苯基)-乙醇为底物,re Sy Hhe C催化底物产生2-(4-硝基苯基)环氧乙烷的比活性为5.2 U/mg。
- 冯峰胡蝶余涛曾妍邬敏辰
- 关键词：宏基因组技术密码子优化
- CBM融合位置对AuMan5A酶学性质的影响被引量：1
- 2019年
- 为探讨碳水化合物结合结构域(CBM)不同融合位置对Aspergillus usamii 5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响,将Thermotoga maritima 27家族CBM分别融合至其C和N末端,构建出融合酶基因Auman5A-cbm27和cbm27-Auman5A。将Auman5A和融合酶基因分别在Pichia pastoris GS115中表达,分析比较表达产物AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的酶学性质。结果表明:AuMan5A、AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A的最适温度Topt分别为70、70℃和60℃;其中AuMan5A-CBM27在68℃及以下保温1 h残余酶活均大于85%,与原酶相比,其热稳定性提高了约8℃,而CBM27-AuMan5A在58℃及以下保持稳定,与原酶相比,降低了2℃。3种酶的最适pH均为4.0;AuMan5A在pH值2.5~7.5范围内保持稳定,2种融合酶在pH 2.0~9.0内均能保持稳定。与AuMan5A相比,AuMan5A-CBM27和CBM27-AuMan5A对角豆胶的Km分别降低了45.0%和26.3%。通过比较3种酶的酶学性质,证实CBM不同融合位置对AuMan5A酶学性质具有重要影响。
- 袁风娇王春娟李雪晴李剑芳邬敏辰
- 关键词：Β-甘露聚糖酶酶学性质
- 宇佐美曲霉环氧化物水解酶基因的克隆与生物信息学分析被引量：1
- 2013年
- 环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH)是酶法拆分消旋体环氧化物,制备光学活性环氧化物和邻二醇的重要酶之一。通过RT-PCR和新构建的THSO-PCR侧翼未知DNA序列扩增技术,克隆了一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的EH基因,命名为Aueh2(GenBank No.KF061095),并对该基因进行了相关生物信息学分析。Aueh2的DNA序列长度为2 481 bp,其中包含了5′端和3′端侧翼调控序列,6个内含子序列和编码cDNA序列。开放阅读框序列长度为1 188 bp,编码395个氨基酸,对应的蛋白质命名为AuEH2;该蛋白质为无信号肽的亲水蛋白质,其理论相对分子质量44.6 kD;其三维结构包含EH典型的"α/β"核心催化结构域和"帽子"结构域,活性中心由催化三联体Asp191、His369和Glu343组成。本课题研究成果为深入研究AuEH2及其应用奠定了基础。
- 胡蝶朱利娟邬敏辰汪俊卿唐存多冯峰余涛
- 关键词：宇佐美曲霉基因克隆生物信息学分析
- β-甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达
- 2012年
- 为实现β-甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达,作者将经SalⅠ线性化的pPIC9K-xynⅡ电转化至工程菌GS115/Anman5A中,经G418浓度梯度筛选后获得能同时高产β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的双重重组子GS115/Anman5A-xynⅡ。SDS-PAGE显示目的蛋白的相对分子质量分别约为52 000,24 100。摇瓶发酵筛选出产酶活性最强的转化株,命名为GSMX2,随后对该菌株的表达条件进行初步优化,优化后的表达条件为:诱导时间120 h,培养基起始pH值为7.0,甘油添加量为1.5%,甲醇添加量为1.5%。在此培养条件下,产β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的活性分别达到37.1 U/mL和193.6 U/mL。
- 李剑芳赵顺阁邬敏辰张慧敏魏喜换
- 关键词：Β-甘露聚糖酶木聚糖酶共表达
- β-甘露聚糖酶末端残基变体对其酶学特性的影响被引量：3
- 2013年
- 本研究用宇佐美曲霉Aspergillus usamii的5家族β-甘露聚糖酶AuMan5A为母本,借助同源建模、分子对接及分子动力学模拟等理性设计方法,将AuMan5A的N-末端和C-末端分别截去3个无规则的氨基酸残基,构建出截短的β-甘露聚糖酶AuMan5AN3C3.将AuMan5A和AuMan5AN3C3的编码基因分别在毕赤酵母GS115中进行表达,对表达产物进行了初步纯化并分析比较了其酶学特性及各自的表达水平.结果表明,reAuMan5A和reAuMan5AN3C3的最适温度Topt均为70℃,reAuMan5AN3C3在60℃的半衰期t1/260为38 min,较reAuMan5A(t1/260=40 min)略有降低;在相同表达条件下,reAuMan5AN3C3上清液的β-甘露聚糖酶活性为73.4 U/mL,较reAuMan5A的52.8 U/mL提高了39.0%;纯化的reAuMan5AN3C3酶比活性为182.7 U/mg protein,较reAuMan5A的126.3 U/mg protein提高了44.7%.与reAuMan5A相比,reAuMan5AN3C3对角豆胶的Km值下降不明显,Vmax值有显著提高.
- 唐存多李剑芳邬敏辰魏喜换赵梅
- 关键词：Β-甘露聚糖酶酶学性质
- 定点突变改善β-甘露聚糖酶AuMan5A的酶学性质被引量：1
- 2017年
- 基于糖苷水解酶5家族(GHF5)β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析,对宇佐美曲霉GHF5β-甘露聚糖酶AuMan5A的关键位点氨基酸实施定点突变以获得酶学性质优良的突变酶AuMan5A^(G320D)。采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Gly^(320)的密码子GGT突变为Asp^(320)的GAC,构建出突变酶基因Auman5A^(G320D)。分别将Auman5A和Auman5A^(G320D)在毕赤酵母GS115中进行了表达,分析了表达产物AuMan5A和AuMan5A^(G320D)的酶学性质。结果表明:AuMan5A^(G320D)的最适温度Topt由突变前的65℃提升至70℃,在70℃的半衰期t_(1/2)^(70)由原酶的10 min延长至25 min;AuMan5A^(G320D)的比活性由突变前的351.2 U/mg提高到1 729.1 U/mg,其催化效率(k_(cat)/K_m)是原酶的9.3倍。将Gly^(320)突变为Asp^(320)不仅改善了AuMan5A的温度特性,而且显著提高了该酶的比活性和催化效率。
- 董运海胡蝶邬敏辰唐诗涵王春娟李剑芳
- 关键词：Β-甘露聚糖酶定点突变温度特性
- Y13F定点突变改良米曲霉中温木聚糖酶的耐热性被引量：2
- 2016年
- 为改良米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶11家族木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其Tyr^(13)(Y13)置换为Phe(F)。基于AoXyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了一种突变酶AoXyn11A^(Y13F);以重组质粒p PIC9K-Aoxyn11A为模板,采用PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Y13的密码子TAC突变为F的TTC,构建了一种突变酶基因(Aoxyn11A^(Y13F));分别将Aoxyn11A和Aoxyn11A^(Y13F)在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中实施了表达,并对重组表达产物AoXyn11A和AoXyn11A^(Y13F)的耐热性进行了分析。结果表明:突变酶的最适温度T_(opt)由突变前的50℃提高到55℃;AoXyn11A^(Y13F)在50℃的半衰期t_(1/2)^(50)为95 min,较AoXyn11A(t_(1/2)^(50)=6 min)延长了约15倍。由此经Y13F定点突变显著改良了野生型木聚糖酶的耐热性。
- 吴芹胡蝶李雪晴袁风娇李剑芳邬敏辰
- 关键词：定点突变疏水相互作用
- 重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生被引量：7
- 2014年
- 为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21 （DE3）中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH.SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa.酶学性质分析表明：该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0～8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg; Zn2＋对其有明显激活作用;该酶对NADP＋的亲和力大于NAD＋且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg.在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0％,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力.
- 余涛胡蝶邬敏辰汪俊卿冯峰顾颖
- 关键词：葡萄糖脱氢酶酶学性质羰基还原酶生物催化
- N-端置换提高木聚糖酶AoXyn11A的耐热性被引量：1
- 2017年
- 为提高米曲霉(Aspergillus oryzae)糖苷水解酶家族(GHF)11木聚糖酶AoXyn11A的耐热性,将其N-端置换为来源于嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的同一家族耐热木聚糖酶pXYL11的对应区域。基于木聚糖酶耐热性的理性设计,采用大引物PCR技术将AoXyn11A基因(Aoxyn11A)的5′-端DNA片段置换为pXYL11人工合成基因(xyn11PM)的对应片段,构建出杂合木聚糖酶ATX11A基因(ATx11A)。分别将Aoxyn11A和ATx11A在毕赤酵母GS115中进行了表达,并分析了重组表达产物AoXyn11A和ATX11A的温度特性。结果表明:ATX11A的最适温度T_(opt)由AoXyn11A的50℃提升至65℃,在60℃的半衰期t_(1/2)^(60)为55 min,较AoXyn11A延长了41.3倍;ATX11A在55℃处理3 h保留60%以上的酶活性,而AoXyn11A处理15 min酶活性完全丧失。本研究通过N-端置换显著改善了AoXyn11A的温度特性。
- 何瑶吴芹殷欣胡蝶邬敏辰
- 关键词：木聚糖酶耐热性分子动力学模拟
