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一株内切葡聚糖酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化: 2024年; 从湖南省长沙县养殖场牛胃秸秆发酵物中分离获得了一株高产内切葡聚糖酶的菌株,命名为SCUEC7.通过菌落形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定SCUEC7菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis).当培养时间为12 h、pH值为6.0、培养温度为37°C、碳源为20.0 g·L^(-1)麦芽糖、氮源为15.0 g·L^(-1)胰蛋白胨、金属离子为1.5 g·L^(-1)的Mn^(2+)的条件下,枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株菌体生长量和内切葡聚糖酶活性均较高.在单因素实验的基础上,响应面法分析显示:培养11.9 h,初始pH值为5.9,麦芽糖含量为19.8 g·L^(-1)时,预测最高酶活力为409.0 U·mL^(-1),内切葡聚糖酶的酶活力实测值与预测值之间有较高的拟合度.SCUEC7菌株产生内切葡聚糖酶活性较高,为其秸秆饲料中的应用奠定基础.; 赵思卡许倍滔冯喆王力张建国李晓华; 关键词：内切葡聚糖酶产酶条件优化响应面法优化

厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件优化: 2024年; 【目的】优化厚垣镰孢霉固体发酵产葡聚糖内切酶的条件,为纤维素酶应用奠定基础。【方法】以厚垣镰孢霉HML278为研究对象,采用固体发酵方法分析其产葡聚糖内切酶的条件即发酵时间、发酵温度、接种量和培养基料液比对葡聚糖内切酶酶活力的影响,通过正交试验筛选厚垣镰孢霉固态产酶的最优发酵条件。【结果】葡萄糖浓度线性回归方程:y=0.0465x+0.0177,R 2=0.999。单因素试验中,料液比为1︰2时酶活最高,为2.86 U/mL;孢子接种量为孢子悬液1.5 mL/100g物料时酶活最高,为3.29 U/mL;发酵温度为40℃时酶活最高,为3.67 U/mL;发酵时间为4 d时酶活最高,为3.67 U/mL。正交试验显示,最优发酵条件为培养基料液比1︰2、发酵温度40℃、发酵时间5 d,葡聚糖内切酶酶活为4.15 U/mL。【结论】优化的厚垣镰孢霉固体发酵条件产葡聚糖内切酶的酶活较高,降解纤维素效果佳。; 张健; 关键词：固体发酵葡聚糖内切酶培养基酶活

低温β-1,4-内切葡聚糖酶的基因挖掘、异源表达及其酶学性质表征: 2024年; β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,并将其在大肠杆菌中实现了可溶性表达,其中大部分存在于周质空间,少部分分泌至胞外。对EgDC酶的酶学性质进行了表征,发现该酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和pH 6.5,其在20℃能保持70%以上活力,且在pH 8.0和pH 9.0的半衰期分别达到83.43 min和53.79 min。EgDC酶具有较好的催化性质,其比酶活力k_(cat)/K_(m)值分别为(26.38±1.43)U/mg和(520.03±17.07)s^(-1)/mg,且对于金属离子以及表面活性剂均具有较强耐受能力。由此可见,新型β-1,4-内切葡聚糖酶EgDC具有较好的催化能力,且在低温、碱性以及存在表面活性剂环境下较为稳定,因此具有潜在的工业应用价值。; 圣弟青钮成拓闫亚楠郑飞云刘春凤王金晶李崎; 关键词：基因挖掘异源表达耐碱性

生孢噬纤维菌内切葡聚糖酶的异源表达及CBM6对其酶学性质的影响: 2024年; 内切葡聚糖酶是纤维素酶系的重要组分之一,但大部分内切葡聚糖酶酸碱耐受性较差。为挖掘新型内切葡聚糖酶,本研究从生孢噬纤维菌CX11基因组中克隆了一个内切葡聚糖酶基因Sm_1350。该基因大小为2 196 bp,编码732个氨基酸,编码蛋白包含一个分泌信号肽、GH5催化结构域、6家族碳水化合物结合模块(CBM6)和一个C末端结构域(CTD)。利用实时荧光定量PCR技术对Sm_1350在不同碳源条件下的相对表达水平进行了分析,结果表明,Sm_1350在纤维二糖和滤纸培养基中的表达水平均显著高于在葡萄糖培养基中的表达水平,推测其在CX11降解纤维素过程中发挥一定作用。本研究构建了Sm_1350及其3种截短突变体,分别为Sm_1350、Sm_1350-GH5-CBM6、Sm_1350-GH5和Sm_1350-CBM6,并在大肠杆菌中进行异源表达。结果表明,去除CTD结构域明显提高了目的蛋白的可溶性表达水平。以CMC为底物时,Sm_1350-GH5-CBM6与Sm_1350-GH5酶活力分别为(7 000.00±50.00)U/g和(2 542.73±35.03)U/g,表明去除CBM6降低了Sm_1350-GH5对可溶性多糖的水解能力。酶学性质分析结果显示,Sm_1350-GH5-CBM6与Sm_1350-GH5均有较好的pH稳定性,去除CBM6结构域只改变了Sm_1350-GH5的最适温度,对最适pH以及温度稳定性没有产生影响。此外,Sm_1350-CBM6具有较强的几丁质结合能力,在蛋白纯化方面具有良好的应用前景。; 盛钧美荆晓凤王继伟陈晓艺李宪臻; 关键词：内切葡聚糖酶生孢噬纤维菌酶学性质

芽孢杆菌发酵液的抑菌活性及葡聚糖酶的基因克隆、表达分析被引量：2: 2023年; 通过液培法和菌丝生长速率法,探究茯苓粉培养基(ABP培养基)诱导芽孢杆菌CmRh1产葡聚糖酶的发酵上清液对苹果炭疽病菌的抑制作用;采用PCR技术克隆葡聚糖内切酶基因,异源表达并初步验证其功能;采用在线生物信息学对芽孢杆菌葡聚糖酶的理化性质、信号肽、跨膜区、保守结构域、二级和三级结构、亚细胞定位等进行预测。结果表明:茯苓粉培养基(ABP培养基)诱导的芽孢杆菌CmRh1发酵上清液对苹果炭疽病菌具有一定的抑菌效果,抑菌率分别为16.07%和14.03%;从芽孢杆菌CmRh1菌株克隆到1个葡聚糖内切酶基因(Glu4),开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为1500 bp,编码499 aa。生物信息学预测,Glu4是1个含有信号肽和1个跨膜结构域稳定的亲水性蛋白质,其分子量约为55 kDa,理论等电点为7.14;保守结构域预测,Glu4属于GH5型纤维素酶家族;二级结构元件主要包括α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲,三级结构为典型的β-三明治结构,符合葡聚糖内切酶的结构特征;Glu4亚细胞定位于细胞外,是一个典型的分泌蛋白。SDSPAGE结合Western blot结果显示,Glu4能在大肠杆菌中表达,其蛋白大小与理论值55 kDa基本相符。重组工程菌具有分泌葡聚糖内切酶能力,为后期葡聚糖内切酶的纯化、酶学性质分析及探究Glu4对苹果炭疽病菌的抑菌活性奠定基础。; 孙紫文孟玉洁杨玉青王亚维张鑫付亚娟侯晓强; 关键词：苹果炭疽病菌葡聚糖内切酶基因克隆抑菌活性

牛瘤胃内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达: 2023年; 为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌,本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板,首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因,然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达EG蛋白,最后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组内切酶的酶活力,分析其酶学性质。结果表明:成功构建表达载体pET-28a::eg,重组菌株E.coli BL21/pET-28a::eg在28℃用IPTG诱导14 h后纯化得到重组的EG蛋白,EG蛋白大小约为50 kDa,刚果红染色有明显水解圈。用DNS法测得EG的酶活为12.60 U·mL^(−1),滤纸总酶活为3.53 U·mL^(−1)。重组酶在不同底物的反应中,羧甲基纤维素钠为底物的酶活力最高,脱脂棉最低。重组酶的最适温度为40℃,最适pH为7.0。在此条件下,Ca^(2+)、Mg^(2+)、Fe^(2+)、K^(+)、Mn^(2+)等离子均可对重组蛋白EG的酶活力具有促进作用,Zn^(2+)可促进但差异不显著,而Hg^(2+)、Cu^(2+)对EG的酶活力具有抑制作用。本研究构建的重组内切酶菌株可以高效水解纤维素,为内切酶的工业应用奠定了基础。; 马春娟杨宇泽邹爱爱孙康永杰万雪瑞王川魏亚琴; 关键词：内切葡聚糖酶大肠杆菌酶活酶学性质

Loop B3对GH7内切纤维素酶功能的影响机制: 2023年; 糖苷水解酶第七家族(GH7)包含内切和外切两类纤维素酶,其中对外切纤维素酶的研究较为成熟,但对内切纤维素酶的研究相对较少。本研究从嗜热真菌Myceliophthora thermophila的基因组中鉴定出一个新型GH7内切纤维素酶Mt Cel7b,其在60℃,pH 5.0时表现出最佳酶活力。在90℃孵育1 h后,Mt Cel7b仍能保留40%以上的活性。经过序列统计分析发现,Mt Cel7b loop B3存在长链型和短链型的进化差异,为了探究loop B3对内切纤维素酶结构和功能的影响,将MtCel7b的长链型loop B3进行截短,构建了B3^(cut)突变体。结果显示,B3^(cut)突变体在高温下的稳定性较野生型提高了约9%-44%,而其对3种纤维素底物的比活性降低了34%-74%。借助分子动力学模拟进一步分析显示,在突变体B3^(cut)中,其loop B3的截短导致催化裂隙两端的loop A3和loop B1发生了显著位移,缩小了催化口袋的空间结构,加强了催化位点周围的氢键作用网络,从而导致酶在高温下更加稳定。本研究阐明了loop B3在GH7内切纤维素酶中的重要作用,为酶分子的改良工作提供了新的参考。; 杨俊钊张新蕊孙清扬郑菲; 关键词：内切纤维素酶嗜热分子动力学模拟

1株耐酸秸秆纤维素降解菌株的筛选、鉴定及其内切葡聚糖酶的异源表达研究被引量：1: 2023年; 试验旨在解决农作物秸秆饲料化过程中,秸秆纤维素难降解、适口性差和营养价值低等问题。试验以玉米秸秆粉为唯一碳源,从堆砌秸秆的土壤中分离筛选出1株耐酸且具有高纤维素酶活性的菌株HSU-20SJ。经3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性,利用形态学、生理生化和16S rDNA进行种属鉴定,通过分子克隆技术,构建内切葡聚糖酶的大肠杆菌异源表达系统。结果显示,菌株HSU-20SJ粗酶液酶活为3.23 U/mL,最适反应pH值为5.0。该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),从菌株HSU-20SJ基因组中获得内切葡聚糖酶基因eg20SJ,异源表达后获得重组酶,分子量约为55 kDa,粗酶液酶活为6.28 U/mL。研究表明,试验在获得耐酸、高纤维素酶活菌株基础上,实现了内切葡聚糖酶基因的异源表达,可为纤维素酶的规模化生产和应用提供参考。; 张超李晓意杨吉武晓乐张洋李孟欣刘宇欣李凯悦; 关键词：纤维素降解内切葡聚糖酶异源表达

Evaluation of thermostable endoglucanase in Paenibacillus lautus strain BHU3 for yield enhancement: 2022年; In the present study,Paenibacillus lautus strain BHU3 isolated from landfill soil was evaluated for the presence of potential endoglucanases which are the first candidate of cellulase enzyme system to act on cellulose.In-silico analysis revealed high potential thermostable endoglucanases which can efficiently interact with cellulose.The most potent and thermostable endoglucanase(locus tag id.CPZ30_18280)belonged to glycosyl family-5 and had interaction energy of−12.981 kcal/mol for the best docked cluster containing three out of ten docking conformations,and Tm value of 73.3℃.MD simulation of 100 ns proved highly stable binding interactions of CPZ30_18280 endoglucanase with cellulose with root mean square deviation(RMSD)values ranging from 0.15 to 0.30 nm.Consistent interactions with characteristic active site residues(tyrosine,tryptophan and aspartate)of glycosyl family-5 endoglucanases were found.Further,to enhance the production of endoglucanases,the fermentation conditions were optimized employing approaches like one factor at a time(OFAT)and response surface methodology(RSM).Maximum activity of endoglucanase was determined at 60℃.The optimized condi-tions for enhanced production of endoglucanase(10.15 U/mL)were pH 6.63,yeast extract conc.3.44 g/L,wheat bran 3.59%,and inoculum size 2.65%.Hence,P.lautus strain BHU3 has enormous potential to synthesize highly efficient thermostable endoglucanases under optimized regime using agro-wastes.Thus,it could find immense industrial applications including large scale cellulose conversion to bioethanol.; Suman YadavAnand Kumar PandeySuresh Kumar Dubey; 关键词：CELLULOSE RAST ENDOGLUCANASE

持续性内切酶EG5C-1的改造及酶学性质被引量：1: 2022年; 为了提高glycosyl hydrolase 5(GH5)家族的持续性内切酶EG5C-1的催化活性,对EG5C-1进行同源建模和分子对接,分析确定了活性架构区域内的23个关键氨基酸残基,并通过丙氨酸扫描、饱和突变和组合突变等方法最终获得催化活性显著提高的突变体D70Q/S235W,并分析其酶学性质。结果表明:D70Q/S235W的最适反应温度为60℃,最适pH为6.0。以羧甲基纤维素钠(CMC)和微晶纤维素(Avicel)为底物进行水解产物分析,突变体D70Q/S235W的主要水解产物为纤维二糖和纤维三糖。本研究筛选获得催化活性和酶学性质显著提高的突变体,可为纤维素酶的蛋白质工程改造奠定基础。; 吕科旻周雨朦吴斌何冰芳; 关键词：蛋白质工程酶学性质纤维素酶

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