李娟
- 作品数：1 被引量：2H指数：1
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- 发文基金：长江学者和创新团队发展计划国家自然科学基金广东省自然科学基金更多>>
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- 基于细胞穿透肽Tat的Cre-Loxp重组酶系统的改造被引量：2
- 2013年
- 目的:构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并入核实现细胞水平的基因敲除。方法:在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-SBP-Tat-EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS-Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE_3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用Ni^(2+)亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Western blot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果。结果:经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低。结论:利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除。
- 邓军刘芸谭婷杨昭君吴莉莉李娟姜勇
- 关键词：细胞穿透肽增强型绿色荧光蛋白核定位信号内化CRE重组酶
