目的:明确何种冻存方案更利于保持1型糖尿病患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells,PBMCs)对胰岛抗原特异性的T细胞反应,更接近于新鲜细胞的状态。方法:本研究系国际免疫学协会-T细胞工作组(IDS-TCW)牵头的国际标准化研究Freezing Study I。中南大学糖尿病中心选取5例新发的T1D患者和年龄、性别相匹配的5例正常对照。所有对象新鲜分离的PBMCs分为3份,一份进行亚型细胞的流式细胞分析和酶联免疫斑点实验(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT),另两等份分别采用低温和室温冻存方案冻存;1个月后分别按低温和室温方案复苏,以台盼蓝染色判定细胞活力;并行流式细胞分析术和ELISPOT检测。ELISPOT中4种抗原[包括人GAD65、内对照、Pediacel(巴斯德五合一疫苗)和PMA]均由IDS-TCW中心化实验室盲法标记,盲法测定。以新鲜PBMCs为参照,比较两种冻存方案下PBMCs的复苏率和活力、各亚型细胞比例和ELISPOT检测结果。结果:1)室温冻存下的PBMCs复苏率和细胞活力均略高于低温冻存方案,但二者差异无统计学意义(分别为61.2%vs 60.1%,77.5%vs 74.9%;P>0.05);2)相比新鲜细胞,两种冻存方案均会造成一定程度的单核细胞的损失[(3.2±1.1)%(低温)和(3.0±0.9)%(室温)vs(7.0±1.1)%(新鲜);P<0.05];而CD4+T,CD8+T,B细胞,NK细胞和NKT细胞比例均无明显变化(P>0.05);3)ELISPOT检测结果显示:对多克隆刺激物PMA诱发的T细胞分泌IFN-γ的反应,在新鲜和冻存复苏细胞间无明显差异;记忆性抗原Pediacel和胰岛抗原GAD65刺激下的特异性T细胞反应在冻存复苏细胞均明显差于新鲜细胞,T1D患者新鲜细胞的GAD特异性T细胞反应的SI为5.1,均高于低温(1.3)和室温(1.4)冻存复苏的刺激指数(SI)(均P<0.05);而且仅新鲜细胞的GAD-反应性T细胞的SI和斑点数均明显高于正常对照(5.1 vs 0.9和8.1 vs 0.1,P<0.05),而两种方案下的冻存细胞的SI在患者和对照未发现差异。
