冯松林
- 作品数：15 被引量：37H指数：4
- 供职机构：华南农业大学兽医学院更多>>
- 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目公益性行业(农业)科研专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白单克隆抗体制备与鉴定被引量：2
- 2016年
- 根据NSP9非结构蛋白参数选取相应30 bp DNA片段,片段串联后人工合成并连接p ET-28a(+)载体,大肠杆菌BL21中表达得到可溶蛋白,镍柱亲和层析纯化后免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞骨髓瘤细胞融合。细胞融合后利用间接ELISA法杂交瘤细胞阳性克隆筛选,2次亚克隆后共获得3株抗PRRSV NSP9单克隆抗体,命名为3B17、3J13、3F19。这3株单抗可与大肠杆菌表达的蛋白产物和PRRSV感染的Marc-145细胞发生特异性反应。在PRRSV感染的Marc-145细胞中,NSP9蛋白表达水平接毒后不断升高,48 h达最高,为深入研究NSP9功能奠定基础。
- 赵孟孟张二芹冯松林郭依嘉阮海宇王文佳邢星张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤
- 广东地区口蹄疫病毒VP1和3A基因的序列分析被引量：1
- 2018年
- 【目的】了解广东地区口蹄疫病毒(FMDV)的遗传变异情况,为我国FMDV流行病学的研究及防控提供基础数据。【方法】对2015—2016年间收集的广东地区猪的病料进行FMDV VP1和3A基因的扩增测序和序列分析。【结果】11株O型FMDV均属耿马谱系毒株,7株A型FMDV均属Asia型毒株。11株O型FMDV的VP1基因与流行毒株相比,GD-MM-3株与O/BY/CHA/2010株序列相似性最高,为95.3%;GD-1株、GD-MM-1株和GD-MM-3株与O/MYA/1/98株序列相似性最高,为90.8%。7株A型FMDV的VP1基因与流行毒株相比,A/GDMM/CHA/2013株与GD-3株序列相似性最高,为99.8%;A/HuBWH/CHA/2009株与GD-3株序列相似性最高,为91.4%。11株O型FMDV的3A蛋白不存在氨基酸的缺失,7株A型FMDV的3A蛋白存在较多氨基酸的缺失。【结论】广东部分地区FMDV基因型复杂,预防控制困难。
- 李琪谢增胜石庆伟陈耀孙彦阔冯松林汪志冀池海刘艺兴邢秀琳张桂红
- 关键词：口蹄疫病毒VP1基因
- 2014—2016年广东省规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征的流行病学调查被引量：6
- 2018年
- 【目的】研究广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况。【方法】2014—2016年共采集广东省各规模化猪场猪组织样品1 137份进行抗原检测,血清样品9 432份进行抗体检测。对不同年份、不同季度、不同区域的PRRSV抗原抗体检测情况进行比较分析,对分离的病毒进行遗传进化分析。【结果】2014、2015和2016年的PRRSV抗原阳性率分别为30.86%、34.35%、37.50%;抗体阳性率为82.86%、68.87%、74.56%。从季度分析来看,第1季度抗原阳性率最高,为40.27%;第2季度抗原阳性率最低,为28.66%;各季度抗体水平均在70%以上。不同区域间的PRRSV感染率差异明显,粤东粤西感染率显著低于珠三角和粤北;在抗体水平上,粤东地区较低,抗体阳性率为69.51%,其他3个区域均高于75%。抗原检测阳性的样品中共分离到69株PRRSV毒株,其中有39株位于Subgenotype I亚群。【结论】广东地区PRRSV抗原阳性率呈逐年上升趋势,抗体水平较高但并不稳定,从病毒分离结果看,Subgenotype Ⅰ亚群为省内主要流行亚群。
- 冯松林邢秀琳陈耀汪志张桂红
- 关键词：流行病学调查抗原检测抗体检测
- 兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒血清在Marc-145细胞上对病毒复制影响被引量：1
- 2016年
- 制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,探索其对病毒复制影响,通过大量培养猪繁殖与呼吸综合征病毒XH-GD株病毒,高速离心后蔗糖梯度纯化浓缩并免疫新西兰大白兔,4免后采集抗血清,ELISA法测定效价。同时将抗血清与病毒共同孵育接种Marc-145细胞,荧光定量PCR和TCID50测定病毒复制情况。成功制备兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清,效价达1640,抗血清可以在m RNA水平和TCID50上降低病毒滴度。结果表明,兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清可以在Marc-145细胞上抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制。
- 赵孟孟孙龙陈耀张雅张二芹冯松林张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗血清MARC-145细胞滴度
- PRRSV XH-GD株NSP9缺失感染性克隆的构建被引量：1
- 2016年
- PRRSV的非结构蛋白NSP9是病毒的一种高度保守的非结构蛋白,为了研究病毒NSP9基因是否为病毒复制所必需基因,将PRRSV XH-GD株的NSP9基因通过融合PCR方法进行缺失,将缺失NSP9基因的感染性克隆转染BHK细胞并进行病毒的拯救。结果表明:不能进行有效的拯救,对照组可以成功拯救。说明NSP9基因的缺失对病毒产生致死的影响,而不是操作手段的问题导致无法成功拯救。
- 赵孟孟冯丽丽冯嘉萍冯松林王文佳张桂红
- 关键词：PRRSV感染性克隆拯救
- 针对nsp9基因的siRNA在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响被引量：3
- 2017年
- 为了验证猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)nsp9基因对PRRSV的复制影响,化学合成针对nsp9基因的siRNA,转染到Marc-145细胞中,接种PRRSV之后分别通过荧光定量和Western blot方法来测定病毒的滴度变化和表达情况。结果发现,转染siRNA的Marc-145细胞中病毒的滴度低于未转染特定siRNA的对照组,同时N蛋白的mRNA和蛋白水平均低于未转染特定siRNA的对照组。初步得出结论nsp9基因为病毒复制关键基因,针对nsp9基因的siRNA会在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制。
- 赵孟孟李华玮何健冯松林张雅张二芹张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒SIRNA滴度
- Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化被引量：3
- 2016年
- 试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSV Nsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×104~1×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。
- 赵孟孟冯松林王文佳邢星冯嘉萍张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR实时荧光定量PCR
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒强、弱毒株Nsp9基因的反向遗传学替换改造被引量：2
- 2016年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒复制中发挥重要作用。为了探索Nsp9基因与病毒的毒力、复制能力及细胞嗜性的相关性,本研究利用反向遗传学技术将PRRSV弱毒疫苗毒CH-1R的Nsp9基因进行克隆,酶切后连接到强毒株XH-GD的感染性克隆上,进行病毒的拯救。结果表明,成功构建替换了CH-1RNsp9基因的重组病毒。对重组病毒的生物学特性研究发现,拯救病毒的生长速度和病毒滴度明显高于亲本毒株rXH-GD,但是低于疫苗毒CH-1R,重组毒株的噬斑大小与CH-1R相似,初步推测疫苗株CH-1R的聚合酶有助于提高病毒的滴度。本试验为进一步研究Nsp9基因对病毒毒力的影响奠定基础。
- 赵孟孟钱娟娟崔甜甜冯松林王文佳邢星冯嘉萍张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传学病毒拯救
- Nsp9基因在Marc-145细胞上对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的影响被引量：3
- 2016年
- 试验旨在验证Nsp9基因是否影响猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的复制。构建含有Nsp9全长基因的质粒pIRES2-EGFP-Nsp9,并转染到Marc-145细胞中,接毒之后分别通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法测定PRRSV N蛋白在mRNA和蛋白水平的表达。结果显示,转染Nsp9基因的Marc-145细胞上PRRSV的N蛋白在mRNA水平上显著高于未转染Nsp9基因的对照组(P<0.05),是对照组的1.5倍,同时转染Nsp9基因后的Marc-145上PRRSV N蛋白水平也明显高于对照组。随着剂量的增加,N蛋白的表达量在mRNA和蛋白水平都有所增加。由以上结果初步可知,Nsp9基因可以在Marc-145细胞上促进PRRSV的复制,Nsp9基因与其复制密切相关。
- 赵孟孟冯松林王文佳邢星冯嘉萍张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒NSPMARC-145
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白的亚细胞定位与功能预测被引量：2
- 2016年
- 为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白9(NSP9)的亚细胞定位,并探索NSP9蛋白在PRRSV复制过程中的定位变化,首先预测NSP9蛋白的生物信息学功能,之后将含有NSP9基因的质粒转染Marc-145细胞,并接种PRRSV,通过间接免疫荧光方法检测NSP9蛋白的表达与定位情况。功能预测结果表明,NSP9蛋白内部存在双向核定位序列、酰胺化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、细胞结合位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、伸展蛋白重复区域、RNA聚合酶结合区域。间接免疫荧光检测结果显示,PRRSV感染之初,NSP9蛋白定位在Marc-145细胞质中,围绕在细胞核附近,随PRRSV感染时间延长,其逐步往细胞核内转移,转移的面积也逐步增多。可见,PRRSV感染会引起NSP9蛋白向核内转移。
- 赵孟孟冯丽丽张二芹马红芳冯松林崔甜甜杨春辉王文佳邢星张雅冯嘉萍张桂红
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒真核表达亚细胞定位
