杨立新
- 作品数：3 被引量：10H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室更多>>
- 发文基金：哈尔滨市科技攻关计划项目国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 牛病毒性腹泻病毒p80蛋白的表达及其单克隆抗体的制备被引量：3
- 2016年
- 为了制备牛病毒性腹泻病毒（BVDV）p80蛋白单克隆抗体,试验采用BVDV接种牛肾细胞（MDBK）,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增出BVDV的p80基因,将其定向克隆到原核表达载体pET30a,得到重组表达质粒pET30a-p80。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌,挑选单菌落并扩大培养,经IPTG诱导和SDS-PAGE以及Western-blot分析表明重组蛋白p80获得了表达,分子质量约为44ku。同时用浓缩的BVDV培养液免疫6-8周龄的Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。利用纯化的重组蛋白p80作为检测抗原的间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆后对获得的杂交瘤细胞进行间接免疫荧光（IFA）和抗体亚类鉴定及腹水的制备和效价的测定。结果表明：重组p80蛋白具有很好的反应性;获得8株稳定分泌针对BVDVp80蛋白的杂交瘤细胞株,分别为3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11;8株杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠制备腹水,采用BVDV作为包被原的间接ELISA方法测得其效价为1×10^5-1×10^7;8株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性;8株单克隆抗体的抗体亚类均为IgM/κ。说明制备的重组p80蛋白单克隆抗体可试用于建立检测BVDV抗原的诊断方法。
- 杨立新朱远茂周跃辉任建乐马磊杨婷薛飞
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒免疫印迹试验单克隆抗体IGM间接免疫荧光试验
- 牛病毒性腹泻病毒LJ36/14的分离与鉴定被引量：4
- 2016年
- 为确定牛呼吸道传染病的病原,本研究对2014年从黑龙江省发生牛呼吸道传染病的某肉牛场采集的40份鼻拭子进行了病毒分离,结果分离到一株牛病毒性腹泻病毒(BVDV),命名为LJ36/14株。病毒鉴定结果表明,分离株在单层MDBK细胞中不产生细胞病变;利用BVDV p80蛋白的单克隆抗体(MAb)进行的间接免疫荧光试验表明接种LJ36/14株的细胞结果显示阳性。分离株的TCID_(50)为10^(5.9)/0.1 mL。对该分离株的5'端非编码区(5'UTR)和Npro基因进化树分析表明该分离株为国内首次分离并鉴定的基因亚型,即BVDV1v亚型。本研究为了解BVDV地理分布和流行情况及BVDV疫苗的制发奠定了基础。
- 朱远茂杨立新马磊任建乐杨婷薛飞
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒间接免疫荧光反转录-聚合酶链式反应
- 牛病毒性腹泻病毒重组p80蛋白的间接ELISA方法的建立被引量：3
- 2020年
- 为建立以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白p80为包被抗原的间接ELISA方法,本研究将重组质粒pET30a-p80转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了p80蛋白以包涵体形式获得了表达,将纯化后的重组p80蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立了检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示,该方法与BVDV阳性血清反应呈阳性,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示本实验建立的间接ELISA方法在阳性血清11280倍稀释时检测结果仍呈阳性,而病毒中和试验结果显示该阳性血清稀释度在1512时检测结果就已为阴性,表明该方法的敏感性较高。重复性试验结果显示批内批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。采用本实验建立的方法与病毒中和试验同时检测90份牛血清,结果显示二者的符合率为95%。利用本研究建立的间接ELISA方法对188份采自国内两个不同地区的牛血清样品进行了检测,检出BVDV阳性血清162份,阳性血清检出率为86.2%。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法可用于国内BVDV的血清流行病学调查,为相关疫病的防控提供技术支持。
- 陈瑞红林俊杨立新杨木娇朱远茂薛飞
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒间接ELISA
