李佑锋
- 作品数：7 被引量：2H指数：1
- 供职机构：湖南师范大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 心脏发育候选基因PYGO1 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定
- 2012年
- 利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER-PYGO1)。首先,针对PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列,经退火插入到由BglⅡ和XhoⅠ酶切的pSU-PER质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1。通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆。通过RT-PCR和Western blot检测pSU-PER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析,发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点,且序列完全一致;RT-PCR和Western blot检测结果显示转染pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此,靶向PYGO1的pSUPER RNAi载体构建成功,为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。
- 刘明刘宪楚周军媚谢华平廖四芳宋文李佑锋吴秀山王跃群
- 关键词：RNA干扰PSUPERH9C2
- 斑马鱼fhlA在骨骼肌发育中的作用
- 调控骨骼肌发育的分子机制尚不完全明了.有证据显示LIM-only蛋白FHL1与骨骼肌的生长以及人体骨骼肌病有关联,但FHL1在骨骼肌发育中的作用还有待阐明.本文以斑马鱼为模型研究了FHL1在斑马鱼中的一个同源基因fhl1...
- 谢华平陈发周作琼李佑锋彭浩邓云吴秀山李永青
- 关键词：卫星细胞
- 文献传递
- 斑马鱼fhIA在骨骼肌发育中的作用
- <正>调控骨骼肌发育的分子机制尚不完全明了。有证据显示LIM-only蛋白FHL1与骨骼肌的生长以及人体骨骼肌病有关联,但FHL1在骨骼肌发育中的作用还有待阐明。本文以斑马鱼为模型研究了FHL1在斑马鱼中的一个同源基因f...
- 谢华平陈发周作琼李佑锋彭浩邓云吴秀山李永青
- 文献传递
- GEFT在心脏中的功能研究
- 心脏作为人类最早发育完成的器官，在整个生命过程中发挥重要作用。心脏的发育与形成取决于其细胞增殖、迁移、死亡和分化在时间和空间上的精确调控。其发育过程涉及一系列调控因子和相关信号通路，这些基因的突变或者异常表达都会导致心脏...
- 李佑锋
- 关键词：心肌肥大
- 文献传递
- 小鼠LRRC10腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达
- 2014年
- 目的:构建含有小鼠Lrrc10(Leucine-rich Repeat Containing protein10)基因的重组腺病毒表达载体。方法:设计小鼠Lrrc10特异性引物,以小鼠cDNA为模板,通过PCR扩增出mLrrc10的编码区,并引入HA标签蛋白和SalΙ酶切位点。该片段经凝胶电泳纯化后插入pMD-18T载体。测序后,用SalΙ和Hind III酶切,将目的片段亚克隆至pAd-track-cmv穿梭载体中。用PmeΙ线性化后,用100 ng转化细菌BJ5183,在细菌内同源重组后得到pAd-Lrrc10质粒。pAd-Lrrc10经PacⅠ线性化后用LipofectamineTM 2000转染293A细胞,包装得到含Lrrc10基因的病毒重组子。将病毒重组子在293A细胞中扩增后,反复冻融得到滴度较高的含Lrrc10的病毒液。将收集的病毒液感染心肌细胞,绿色荧光观察GFP、免疫印迹检测Lrrc10-HA蛋白的表达。结果:用病毒液感染原代心肌细胞,24小时后在荧光显微镜下可观察被感染的细胞发出绿色荧光,提取心肌细胞总蛋白,Western可检测到Lrrc10-HA融合蛋白的表达。结论:小鼠Lrrc10腺病毒载体构建成功,并可将编码Lrrc10-HA的目的片段导入心肌细胞中表达。
- 周作琼彭夕洋肖丽娜李佑锋彭浩吴秀山范雄伟李永青
- 关键词：腺病毒载体心肌细胞
- TCF25干扰慢病毒载体的构建与鉴定被引量：2
- 2016年
- 为构建一个针对TCF25(transcription factor 25)基因的慢病毒干扰载体,设计并合成3组针对TCF25的短发夹RNA序列(shRNA),通过基因重组技术连入p LL3.7载体,酶切鉴定及DNA测序后,重组正确的p LL3.7质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞,培养48 h后,分别收集细胞培养上清液,感染H9C2细胞,Western-blot检测TCF25在H9C2细胞中的表达.结果显示TCF25蛋白在H9C2细胞中的表达被抑制.这说明TCF25的慢病毒干扰载体构建成功.
- 李佑锋彭浩高建芳高晶陈宇吴秀山李永青
- 关键词：H9C2细胞慢病毒载体
- Txt5腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的表达
- 2015年
- 设计小鼠Txt5基因的特异性引物,将小鼠c DNA作为模板,用PCR扩增出m Txt5编码区,并加入HA标签序列.将这一片段插入p MD-18T载体,再亚克隆至p Adtrack-cmv穿梭载体上.线性化后,转化BJ5183感受态细胞,在BJ5183中发生同源重组获得p Ad-Txt5质粒.p Ad-Txt5线性化后转染293A细胞,包装得到含Txt5基因的病毒.将病毒溶液感染大鼠原代心肌细胞,一段时间后观察绿色荧光,然后通过RT-PCR和免疫印迹法检测HA标签蛋白的表达.结果表明成功构建小鼠Txt5腺病毒表达载体并实现在大鼠原代心肌细胞中的表达.
- 彭浩陈宇李佑锋朱旋周作琼吴秀山范雄伟李永青
- 关键词：腺病毒心肌细胞
