采用RT-PCR、RT-半巢式PCR(seminested PCR)和RT-环介导等温扩增(LAMP)三种分子生物学方法分别检测了牡蛎中经粪便污染的诺如病毒。三种方法所采用的特异性引物均针对诺如病毒高度保守的N/S结构域。结果显示:一步法RT-PCR较两步法结果理想但仍不能有效去除食品中的PCR反应抑制物。RT-半巢式PCR和RT-LAMP的特异性和敏感性都远远优于RT-PCR,但是RT-半巢式PCR操作繁琐费时。RT-LAMP扩增程序简单、反应时间短,且不需要精密的温度循环装置,在产物中加入SYBR Green Ⅰ染料后可用肉眼直接判断反应结果。因此,RT-LAMP有望发展成为快速检测牡蛎中诺如病毒的有效手段。
实时荧光定量PCR(q PCR)是检测食源性病毒的常用方法,其高度的灵敏性导致检测过程中容易产生假阳性结果。基因序列比对法是比利时根特大学食品微生物与食品保藏实验室新近建立的验证q PCR阳性结果真伪的一种方法。本研究以检测贝类诺如病毒GII.4(No V GII.4)为例,采用基因序列比对法验证q PCR阳性结果的真伪。在q PCR检测时添加102copies/m L的No V GII.4质粒作为标准阳性对照,旨在排除由于q PCR的高灵敏性而产生的假阳性结果。研究结果表明,在8份No V阳性的贝类样品中,2份为No V GII.4真阳性,2份可能为No V GII.4的变异株,1份为受到质粒污染的假阳性,其余3份为引物二聚体所致假阳性。基因序列比对法作为一种验证q PCR阳性结果真伪的高效、可行的方法,值得推广。
