刘晓清
- 作品数：1 被引量：0H指数：0
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- 靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选
- 2011年
- 目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1（TREM-1）基因短发夹RNA（shRNA）真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组（A组）、转染空质粒载体pGCsi对照组（B组）、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组（C组）、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组（D组）和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组（E组）,48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达（[（1.945±0.252）×105比（1.010±0.194）×105,（1.933±0.216）×105比（1.202±0.171）×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.
- 莫红缨黎毅敏肖正伦黄红川杨淳何为群刘晓清
- 关键词：短发夹RNA质粒RNA干扰基因表达
