王超
- 作品数：2 被引量：7H指数：1
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- 发文基金：国家自然科学基金北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养项目更多>>
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- 心肌肌球特定基因-肌球蛋白轻链基因可在人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞表达被引量：1
- 2016年
- 目的:探讨人心肌肌球蛋白轻链(2v)基因启动子(p MLC2v)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luc)报告基因慢病毒载体在人脐带间充质干细胞(h UCMSC)向心肌样细胞分化中的表达。方法:酶消化法原代分离培养h UCMSC,采用流式细胞仪鉴定分析其细胞表面标记物及检测体外向成骨细胞、成脂细胞、内皮细胞诱导分化潜能;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导h UCMSC定向分化成心肌样细胞;诱导细胞并同时转染p MLC2v-GFP,于d3,d7,d10,d14,d17及d21时间点在荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测其阳性率;用生物发光检测仪检测相同时间点的萤光素酶(p MLC2v-Luc)报告基因慢病毒载体转染分化细胞发光特征;在激光共聚焦显微镜下观察p MLC2v-GFP及红色荧光蛋白(RFP)共转染诱导21d后分化细胞蛋白的表达分布状况;与鼠心肌细胞作为对照,脉冲电流激发细胞收缩和细胞内及细胞间的钙离子流,以检测诱导分化细胞"兴奋-收缩"偶联功能;Western blot法检测诱导分化细胞p MLC2v蛋白的表达。结果:原代培养的P3 h UCMSC,经FCM检测CD90、CD105及CD73阳性率均为99%以上为高表达;获得的细胞分别经体外诱导能够向成骨细胞、成脂细胞、成内皮细胞分化;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导h UCMSC同时并转染p MLC2v GFP,在荧光显微镜下观察并用流式仪检测GFP表达阳性细胞数随诱导时间的延长而增加(P<0.05);生物发光检测仪检测诱导细胞p MLC2v-Luc表达同样呈阳性递增;p MLC2v GFP及RFPC共转染诱导21d后分化的细胞,细胞浆内形成较清晰的与细胞长轴平行的肌束样结构;诱导后的细胞用共聚焦显微镜检测无细胞内及细胞间的钙离子流动;随诱导时间的延长p MLC2v蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论:在h UCMSC体外诱导形成心肌样细胞过程中,p MLC2v基因随诱导时间的延长而表达增加,为监测干细胞的移植在心肌疾病治疗中提供了实验依据。
- 辛毅李娜许秀芳崔巍刘飒王超黄益民张颖周玉杰
- 关键词：心肌样细胞肌球蛋白轻链
- 人脐带间充质干细胞外泌体对高糖诱导脐静脉内皮细胞功能的影响被引量：6
- 2017年
- 目的探讨人脐带间充质干细胞（hUMSCs）外泌体对高糖诱导人脐静脉内皮细胞（hUVECs）功能的影响。
方法酶消化法原代培养hUMSCs和hUVECs，传代扩增至第3代，采用流式细胞仪分别鉴定2种细胞表面标志物；收集培养的第3代hUMSCs无血清培养基，提取外泌体，在电镜下观察其超微结构，并用流式细胞分析仪鉴定其表面标志物；体外培养第3代hUVECs分为对照组、高糖组（20 mmol/L）、外泌体＋高糖组（20 mmol/L）、miR－22抑制剂（50 nmol/L）＋高糖组（20 mmol/L），孵育24 h后采用Annexin V/PI双染流式细胞术观察hUVECs凋亡，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察各组细胞的增殖能力，Transwell系统中观察各组细胞的迁移功能，成血管实验检测各组内皮细胞功能。
结果流式细胞术检测第3代hUMSCs的表面标志物CD105、CD73、CD90呈高表达；同时检测第3代hUVECs表面标志物CD309、CD31、CD34呈高表达，提示分离培养的hUMSCs和hUVECs具有间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和内皮细胞（endothelial cells，ECSs）特异性表型特征。外泌体扫描电镜观察可见大小不一的球状膜性结构，且流式细胞仪检测CD63、CD105、CD73、CD90、CD44呈阳性表达。MTT法检测各组细胞增殖结果：对照组、高糖组、miR－22抑制剂＋高糖组、外泌体＋高糖组细胞存活率分别为（99.0±1.6）%、（75.0±2.2）%、（66.0±1.8）%、（95.0±2.6）%，与对照组比较，高糖组和miR－22抑制剂＋高糖组细胞增殖明显下降，差异均有统计学意义（t＝28.271，P〈0.05；t＝43.213, P〈0.01）,外泌体＋高糖组细胞增殖无明显下降，差异无统计学意义（t＝2.001，P〉0.05）。流式细胞仪检测各组细胞凋亡结果：对照组、高糖组、miR－22抑制剂＋高糖组、外泌体＋高糖组细胞凋亡率分别为16.44%、52.67%、45.92%、17.58%，与对照组比较，高糖组和miR－22抑制剂＋高糖组�
- 辛毅李娜黄然然崔巍刘飒王超黄益民张颖周玉杰
- 关键词：人脐带间充质干细胞人脐静脉内皮细胞外泌体高糖
