涂然
- 作品数：40 被引量：30H指数：4
- 供职机构：中国科学院天津工业生物技术研究所更多>>
- 发文基金：中国科学院科研装备研制项目国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程自动化与计算机技术更多>>
- 硝化细菌的高通量检测和分离方法
- 本发明公开了一种硝化细菌的高通量检测和分离方法。本发明提供了一种富集和/或分离硝化细菌的方法：将菌液样本依次进行分散处理和稀释；将稀释液分别接种于NOB培养基和AOB培养基进行培养，然后检测培养体系中的氨氮含量、亚硝酸态...
- 涂然吕彤王钦宏
- 文献传递
- 一种高通量筛选酮类化合物的检测方法及其在酶筛选中的应用
- 本发明公开了一种高通量筛选酮类化合物的检测方法及其在酶筛选中的应用。本发明提供了5‑甲氧基‑2‑氨基苯甲酰胺肟的应用，为如下(a1)‑(a4)中的至少一种：(a1)酮类化合物含量的检测；(a2)酶活性的检测；(a3)高活...
- 孙周通张锟梅泽龙涂然曲戈
- 文献传递
- 增强红色糖多孢菌的红霉素生产能力的方法及其获得的菌株
- 本发明涉及红色糖多孢菌中SACE_3478基因扰动对于提升红霉素产量的应用，具体公开一种增强红色糖多孢菌的红霉素生产能力的方法，其通过基因工程手段将出发菌株红色糖多孢菌中SACE_3478基因进行敲除、失活、表达降低、或...
- 王猛张玥涂然
- 文献传递
- 一种基于微芯片快速生成双层乳化液滴的方法被引量：1
- 2020年
- 体外区室化(In vitro compartmentalization,IVC)是通过制备微液滴反应小室包裹单个基因(包含表达体系)或细胞进行反应和培养,从而建立表现型与基因型的偶联,并借助流式细胞仪(Fluorescence-activatedcell sorting,FACS)对液滴进行超高通量检测和筛选,进而快速获得目标基因或细胞的一种方法。IVC-FACS筛选方法已被广泛应用于蛋白质工程、酶工程等定向进化研究。但早期利用机械分散法生成的微液滴大小均一性难以控制,严重影响液滴的定量检测,降低了筛选的效率和准确性。随着微流控芯片制备技术的快速发展,在芯片内快速生成微液滴的技术也愈加成熟。本研究首先利用W/O(Water-in-oil)单层液滴生成芯片高速制备单分散的W1/O液滴,再将W1/O液滴重注入W/O/W(Water-in-oil-in-water)双层乳化液滴生成芯片制备均一的W1/O/W2双层乳化液滴。通过对油、水相流速与比值的优化,可以生成直径在15.4–23.2μm的单乳化微液滴,液滴可在培养数天内保持稳定。将单乳化液滴重注入双层乳化液滴芯片,通过调整油相流速,可以获得生成速度在1000个液滴/s、直径在30–100μm的双层乳化液滴。利用双层乳化液滴包埋的大肠杆菌细胞能正常进行培养和目标蛋白的诱导表达,为后续建立基于液滴和流式细胞仪的菌株高通量筛选方法奠定基础。
- 白立宽袁会领涂然王钦宏花尔并
- 关键词：微流控芯片高通量单细胞流式细胞仪
- 一种低温碱性蛋白酶及其制备方法
- 本发明公开了一种低温碱性蛋白酶及其制备方法，其在低温条件下尤其4‑15摄氏度条件下，在平板酶解圈法和荧光显色法测试中均比野生株的碱性蛋白酶具有更好的酶活，具备应用于洗涤产品的前景，且在制备过程中利用了不同的枯草芽孢杆菌的...
- 赵磊涂然王钦宏马延和
- 一种基于双酶偶联高通量检测微生物生产异戊醇的新方法
- 本发明涉及一种基于双酶偶联反应的高通量检测微生物生产异戊醇的新方法，其中，异戊醇氧化酶为重组毕赤酵母表达所得。具体涉及利用异戊醇氧化酶和过氧化物酶偶联，在相应缓冲溶液中与异戊醇的反应，产生显色物质醌亚胺。双酶偶联反应在9...
- 王钦宏孙琳涂然
- 文献传递
- 毕赤酵母液滴微流控高通量筛选方法的建立与应用被引量：7
- 2019年
- 巴斯德毕赤酵母是当前应用最为方便和广泛的外源蛋白表达系统之一,为了进一步提高其表达外源蛋白的能力,文中建立了基于液滴微流控的毕赤酵母高通量筛选方法,并以木聚糖酶融合荧光蛋白为例,筛选获得木聚糖酶表达和分泌能力提高的突变株。通过PCR扩增得到木聚糖酶xyn5基因和绿色荧光蛋白gfp基因融合片段,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建出木聚糖酶融合绿色荧光蛋白的质粒pPIC9K-xyn5-gfp,电转化至毕赤酵母GS115中得到表达木聚糖酶和绿色荧光蛋白的毕赤酵母SG菌株。该菌株经过常压室温等离子体诱变后进行单细胞液滴包埋,液滴培养24h后进行微流控筛选,获得高表达木聚糖酶的突变菌株,进而用于下一轮的诱变突变库构建和筛选。以此类推,经过5轮液滴微流控筛选,获得一株高产菌株SG-m5,其木聚糖酶活为149.17U/mg,较出发菌株提升300%,分泌外源蛋白的能力较出发菌株提高160%。文中建立的毕赤酵母单细胞液滴微流控高通量筛选方法能达到每小时10万菌株的筛选通量,筛选百万级别的菌株库仅需10h,消耗荧光试剂体积100μL,对比传统的微孔板筛选方法降低试剂成本近百万倍,为高效、低成本筛选获得表达和分泌外源蛋白能力提高的毕赤酵母提供了一条新途径。
- 吕彤涂然袁会领刘浩王钦宏
- 关键词：毕赤酵母高通量筛选单细胞蛋白分泌
- 一种基于液滴微流控芯片的微生物高通量检测系统
- 一种基于液滴微流控芯片的高通量检测系统，主要包括液滴微流控芯片系统(1)、光路系统(2)、数据采集分析系统(3)构成；其中液滴微流控芯片系统(1)将待检测微生物包埋形成独立单液滴微反应小室，通过光路系统(2)进行单液滴微...
- 王钦宏涂然袁会领孙琳
- 文献传递
- 纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法
- 本发明公开了一种纤维素酶高产菌株的高通量筛选方法，包括：步骤一、将纤维素酶产生菌的孢子置于湿室培养，直至孢子萌动至接近萌发的状态结束湿室培养；步骤二、采用液滴微流控技术将孢子、培养基以及纤维素酶标记底物包埋于液滴中，进行...
- 赫荣琳涂然张东远
- 文献传递
- 高通量构建与筛选信号肽库提高枯草芽孢杆菌外源蛋白的表达分泌
- 2024年
- 【目的】基于信号肽在分泌表达系统中的重要作用,利用自动化高通量设备,搭建枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)酶蛋白信号肽库的高通量自动化构建与筛选平台,探索枯草芽孢杆菌中不同信号肽对酶蛋白的表达分泌作用。【方法】首先以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pHP13以及pMA5为骨架,将编码毒性蛋白的ccdB基因插入大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体的启动子和目标基因之间,构建针对绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)以及普鲁兰酶(pullulanase,PulA)的信号肽筛选载体。以枯草芽孢杆菌168基因组为模板,扩增173条信号肽序列,基于高通量自动化设备搭建枯草芽孢杆菌外源蛋白表达及活性筛选平台,构建含有不同信号肽的外源蛋白重组菌株,筛选并考察不同信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。【结果】RpmG、AspB、CitH、LytF和YkwD这5个信号肽具有较强的引导GFP胞外蛋白分泌能力,其中RpmG引导GFP胞外分泌能力最强,其重组菌株与对照菌株相比胞外GFP的荧光值提高了236%。针对PulA的信号肽筛选,其中41个信号肽与PulA的适配性很低,2个信号肽RpmG、AspB引导PulA胞外分泌的能力较强。含AspB信号肽的PulA重组菌株分泌率可达到74%,与对照菌株相比分泌率提高了68%;RpmG信号肽引导的PulA酶活与其他信号肽相比最高,总酶活可达116 U/mL,细胞外酶活为52 U/mL。【结论】本研究建立了枯草芽孢杆菌酶蛋白信号肽库的高通量自动化构建与筛选平台,分别获得可以提高GFP和PulA表达分泌的信号肽。该自动化平台允许大量样品的并行处理,这简化了纯手工的重复性实验工作,并且我们发现高通量实验平台不论在时间和成本方面都优于手工操作。自动化高通量平台的优势将随着样本量的增加而更加显著。综上所述,我们建立的自动化高通量筛选平台不仅可以加速外源蛋白的信号肽筛选优化过程,也为其他高�
- 李昊霓李颖于思礼涂然涂然花尔并刘扬
- 关键词：枯草芽孢杆菌信号肽
