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双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库的构建与鉴定被引量：3: 2015年; 构建双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库,并对文库质量进行鉴定。采集未经免疫的6月龄雌性双峰驼外周血、骨髓、脾和淋巴结,并从外周血中分离淋巴细胞。抽提总RNA,反转录为cDNA,用2对引物经过2轮PCR扩增得到400bp左右的双峰驼VHH片段。根据Clontech公司Mate&PlateTMlibrary construction system使用手册,将带有同源臂的VHH片段与线性化的pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母感受态细胞,转化产物涂布SD/-Leu平板,30℃倒置培养3~5d后,收集平板上的所有克隆,即为双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库。对文库的滴度、重组效率及多样性进行鉴定。结果显示,本研究构建的双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库库容为2.07×107,滴度为7.6×108cfu·mL-1。随机挑取47个独立克隆进行菌落PCR鉴定,43个含有VHH片段,重组率为91.5%;选取其中19个测序,均为独立克隆,且多样性好。该研究成功构建双峰驼天然重链抗体可变区酵母双杂交文库,且文库质量满足要求,为进一步获得特定抗原的VHH奠定了基础。; 胡湘云高小龙付向晶刘丹丹范文涛王燕平杜恩岐王兴龙党如意杨增岐; 关键词：双峰驼酵母双杂交

副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法的建立与应用被引量：4: 2015年; 【目的】建立快速检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法,以便能够对副猪嗜血杆菌病进行快速、准确的诊断。【方法】利用9株(Ea、Ec、Ew、A1、A2、B1、B2、C1、C2)副猪嗜血杆菌陕西分离株制备平板凝集抗原,用其免疫健康家兔制备血清抗体,建立副猪嗜血杆菌平板凝集检测方法,对制备抗原的优势菌株进行筛选,并对该方法的特异性、敏感性、抗原最佳工作浓度进行检测。【结果】选出Ew株作为制备抗原的种子菌株,成功建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的平板凝集试验方法;该方法具有良好的特异性和敏感性,抗原最适工作浓度为8×109 CFU/mL。采用本试验建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法对临床血清样品的检测结果与临床诊断结果基本一致。【结论】建立的副猪嗜血杆菌平板凝集试验方法能够对副猪嗜血杆菌病做出较为快速、准确的诊断;陕西省存在副猪嗜血杆菌不同程度的感染,规模猪场集中饲养的猪感染副猪嗜血杆菌的比率明显高于散户。; 高艳张定全杨增岐梁留存刘海金吴朋朋高小龙常旭东杜恩岐; 关键词：副猪嗜血杆菌抗原制备平板凝集抗体检测

新城疫病毒F蛋白纳米抗体的筛选及活性鉴定被引量：8: 2016年; 旨在筛选新城疫病毒(NDV)F蛋白的纳米抗体,并对筛选的抗体活性进行初步鉴定。以NDV F蛋白中和表位构建诱饵,利用酵母双杂交技术对双峰驼天然重链抗体可变区(VHH)酵母双杂交文库进行筛选,获得4株VHH抗体序列。挑选其中2株最符合VHH特征的进行原核表达与纯化,并对2株VHH活性进行鉴定。ELISA结果显示,VHH1与VHH2与NDV病毒的反应性显著高于阴性对照(P<0.05),表明VHH与NDV病毒反应活性良好;Western blot结果显示,2株VHH可特异性识别F蛋白;细胞中和试验结果表明,2株VHH抗体均具有一定的中和活性。以上结果提示本研究成功筛选出2株活性较好的抗NDV F蛋白的VHH抗体,为VHH在NDV防控中的应用奠定了基础。; 高小龙胡湘云付向晶王燕平仝丽娜王海新王兴龙张淑霞萧飒杜恩岐杨增岐; 关键词：新城疫病毒 F蛋白酵母双杂交

禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白纳米抗体的筛选及活性检测被引量：4: 2016年; 禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交技术对非免疫双峰驼纳米抗体酵母文库进行筛选。随机选择15个用QDO/X/A平板筛选到的纳米抗体(Nanobody or VHH)阳性克隆,经过酵母共转验证、序列测定分析,最终选择在QDO/X/A平板显强阳性且序列正确的8株VHHs在E.coli BL21(DE3)中进行表达、纯化;间接ELISA结果表明,筛选出的8株纳米抗体均与AEV标准抗原具有反应原性,其中2株纳米抗体VHH4、VHH9的活性高于阳性对照。这一结果为AEV的检测与病原研究奠定了一定的基础。; 范文涛杜恩岐高小龙萧飒李志军范莉莉郝华芳王兴龙党如意张淑霞杨增岐; 关键词：禽脑脊髓炎病毒 VP1蛋白

新城疫病毒HN蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定: 2016年; 【目的】应用酵母双杂交技术构建新城疫病毒的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白线性中和表位区的诱饵载体pGBKT7-HN-neu,为筛选靶向新城疫病毒HN蛋白的中和性纳米抗体奠定基础。【方法】合成HN蛋白的线性中和表位区HN-neu,将其克隆至酵母双杂交系统诱饵载体pGBKT7中,构建诱饵载体pGBKT7-HN-neu,经酶切鉴定和测序验证正确后,将pGBKT7-HN-neu转化酵母菌Y2H Gold,检测其在酵母细胞中的毒性和自激活作用。【结果】成功合成了HN-neu,构建的pGBKT7-HN-neu在酵母细胞Y2H Gold中无毒性和自激活能力。【结论】成功构建了诱饵载体pGBKT7-HN-neu。; 胡湘云高小龙付向晶王燕平刘丹丹常旭东刘蓬杜恩岐王兴龙党如意杨增岐; 关键词：新城疫病毒 HN蛋白酵母双杂交系统诱饵载体

新城疫病毒La Sota及F48E9毒株P和V及W蛋白C端功能域的原核表达及其多克隆抗体的制备: 2017年; 以新城疫病毒La Sota、F48E9株为模板,扩增获得P、V、W基因C末端。原核表达后利用Ni柱纯化6种融合蛋白,并制备6种多克隆抗体,ELISA效价测定结果均大于1∶2 560,Western-blot试验结果表明其具有良好的特异性。本研究成功地制备了La Sota、F48E9株P、V、W蛋白的多克隆抗体,为进一步研究新城疫病毒P、V、W蛋白的生物学功能奠定了基础。; 王重阳任善会贾燕青王相伟高小龙张淑霞萧飒王兴龙杨增岐; 关键词：新城疫病毒多克隆抗体

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高小龙