刘立兵
- 作品数：8 被引量：90H指数：5
- 供职机构：河北出入境检验检疫局更多>>
- 发文基金：国家质检总局科技计划项目河北省自然科学基金博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- 鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测方法的建立被引量：10
- 2016年
- 为建立鸭坦布苏病毒(DTMUV)的检测方法,本研究根据GenBank中登录的DTMUV E基因保守区域设计引物和探针,建立了检测DTMUV的一步法RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法,并比较了两种方法的敏感性和特异性。结果显示,荧光定量RT-PCR标准曲线的相关系数(R^2)为0.999,DTMUV RNA在10~2拷贝/μL^10~7拷贝/μL范围内与Ct值呈现良好的线性关系;两种方法均仅对DTMUV RNA具有特异性扩增,而对其他常见鸭病原核酸的扩增均为阴性,具有较强的特异性;一步法RT-PCR对鸭胚纯培养病毒RNA的检测下限为10~3拷贝/μL,而荧光定量RT-PCR的检测下限为10~2拷贝/μL;重复性试验的变异系数均小于1.5%。对20份模拟临床样品的检测结果表明,一步法RT-PCR的阳性率为75%(15/20),而荧光定量RT-PCR的阳性率为90%(18/20)。本研究表明所建立的DTMUV荧光定量RT-PCR特异性强、重复性好、敏感性更高,更适用于DTMUV的临床诊断和流行病学调查。
- 王建昌王金凤袁万哲刘立兵
- 关键词：荧光定量RT-PCR一步法RT-PCRE基因
- 我国进口种鸡群禽白血病及禽网状内皮组织增生症的血清学检测
- 2015年
- 为了解河北进口种鸡群禽白血病病毒(ALV)及禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的感染情况,对实验室留存的2011—2013年间来自美国、加拿大和法国的15批进口种鸡的血清样品450份,通过ELISA方法进行ALV-A、B亚群和REV的抗体检测。结果共有8批28份样品为ALV-A、B亚群抗体阳性,群体阳性率和个体阳性率分别为53.3%和6.2%;未检出REV抗体阳性样品。结果表明目前我国进口种鸡群中存在一定比例的禽白血病病毒A、B亚群抗体阳性个体。
- 王建昌付琦王金凤李静孙晓霞刘立兵
- 关键词：禽白血病间接ELISA血清学检测
- 沙门氏菌重组酶聚合酶检测方法的建立及应用被引量：18
- 2019年
- 建立一种重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification,RPA)检测沙门氏菌(Salmonella)的方法。本研究依据沙门氏菌侵袭蛋白A基因(invA)的保守序列设计特异性引物,通过对反应时间的优化,建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应20 min,即可实现对目的片段的有效扩增;除沙门氏菌外,其他26 种食源性致病菌均无扩增,具有良好的特异性;以沙门氏菌基因组DNA作为模板,该方法的检测灵敏度为1.1×10^(-3) ng/μL,与本研究应用的实时荧光聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,PCR)方法一致;人工污染实验表明,当羊肉、鸡肉和西兰花样品污染量为4 CFU/25 g,增菌8 h,即可通过RPA方法检出沙门氏菌。在人工污染实验中,RPA和PCR检测结果一致。本研究建立的沙门氏菌的RPA检测方法特异性强、操作简单、为食源性致病菌的鉴定提供了一种新的方向。
- 刘立兵耿云云姜彦芬刘思颖刘思颖孙晓霞王建昌
- 关键词：沙门氏菌
- Hobi样病毒研究进展被引量：2
- 2016年
- Hobi样病毒(Hobi-like virus)是一种可感染牛的新病毒,2004年其遗传学和抗原特征被首次确认,将之归入黄病毒科,瘟病毒属。该病毒主要在胎牛血清、牛源细胞系中检测到,同时在临床自然发病动物中也不断被检测并分离到。目前研究表明Hobi样病毒主要分布于南美、欧洲和亚洲,并且在南美和亚洲某些地区呈地方流行性分布。Hobi样病毒的宿主范围目前尚不明确,牛、绵羊等反刍动物感染后出现明显的临床症状并向外排毒;猪感染后仅表现轻微的抗体滴度上升,没有任何临床症状。牛感染Hobi样病毒后的症状同牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染相似,主要表现为腹泻,部分出现呼吸系统症状、繁殖障碍和出血性综合征等。BVDV疫苗能够诱导产生针对Hobi样病毒的免疫抗体,但是不足以提供有效的保护力。目前检测BVDV的方法不能有效检测Hobi样病毒或者无法区分BVDV和Hobi样病毒。当前已经建立了针对Hobi样病毒的特异性荧光RT-PCR检测方法,将为该病毒的流行病学调查奠定坚实的基础,进而对反刍动物瘟病毒的防控和清除,以及疫苗等生物制品的生物安全的保障具有十分重要的意义。
- 王建昌王金凤刘立兵
- 关键词：流行病学临床症状
- 口蹄疫病毒实时荧光RT-RPA快速检测方法的建立被引量：9
- 2019年
- 为建立一种简单、快速、特异的口蹄疫病毒(FMDV)分子检测方法,本研究基于FMDV的3D基因,设计特异性引物和exo探针,建立了用于FMDV快速检测的等温实时荧光反转录重组酶聚合酶(Real-time RT-RPA)方法。该方法采用便携式等温扩增仪-Genie Ⅲ实时监测扩增结果,40℃20 min即可完成检测。结果显示,FMDV RT-RPA方法能够特异性扩增FMDV 3D基因,而对水泡性口炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、脑心肌炎病毒等均无扩增;以体外转录的FMDV 3D RNA作为模板,该方法在95%置信区间检出下限为1.0×10~2拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1%;使用43份含有灭活FMDV的模拟临床样品分析显示,RT-RPA对FMDV的检出率为34.9%(15/43),略低于荧光定量RT-PCR的检出率(39.5%,17/43),而两种方法的符合率为95.3%(41/43)。RT-RPA能够在6 min～16 min内完成检测,而实时荧光RT-PCR则需要30 min～51 min。本研究所建立的实时荧光RT-RPA方法反应快速,特异性强,灵敏性高,操作简单,结合便携式具有荧光检测功能的等温扩增仪Genie Ⅲ,组建了FMDV快速检测平台,在基层兽医部门,尤其在野外及疫情现场的FMDV检测中具有极大的应用潜力,为设备仪器有限的实验室和田间对FMDV的快速检测提供了一种有效的方法,对于条件有限地区FMD的防控具有重要意义。
- 刘立兵刘立兵张若曦王金凤韩庆安李睿文韩庆安李睿文
- 关键词：口蹄疫病毒3D基因
- 食品中蜡样芽胞杆菌实时荧光RPA检测方法的建立与应用被引量：10
- 2018年
- 为实现简便快速地检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),根据Gen Bank中蜡样芽胞杆菌16 S RNA序列设计特异性引物和exo探针,建立了一种实时荧光重组酶聚合酶扩增方法,在39℃恒温下仅需20 min即可完成检测。该方法特异性扩增蜡样芽胞杆菌16 S RNA基因片段,对其他芽胞杆菌和非芽胞杆菌无扩增;以蜡样芽胞杆菌基因组DNA作为模板,该方法的检测灵敏度为1.0×10-3ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染实验表明,当大米饭中蜡样芽胞杆菌污染量≥1.5×104CFU/g时,即可通过real-time RPA方法检出,所需时间仅为6~13min;而当污染量≥1.5×105CFU/g时,才能通过real-time PCR方法检出,所需时间至少为30 min(Ct值为20~31)。
- 刘立兵南汇珠孙晓霞孙晓霞王金凤王建昌
- 关键词：蜡样芽胞杆菌
- 伪狂犬病病毒野毒和疫苗毒双重RPA鉴别检测方法的建立和应用被引量：5
- 2018年
- 为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒和疫苗毒的快速鉴别检测方法,本研究基于PRV gB和gE基因保守区域设计引物,建立了一种双重重组酶聚合酶扩增方法(RPA)。本研究所建立的双重RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应20min,能够在同一个反应体系中实现对PRV野毒和疫苗毒的特异性鉴别检测,而与其它常见的猪病毒没有交叉反应。所建立的双重RPA方法对PRV gB和gE基因的检测限均为102拷贝,并且与荧光定量PCR方法检测限一致。通过对4株不同PRV株和37份临床样品的检测,结果表明双重RPA方法能够实现对不同PRV株的检测,对临床样品中PRV gB和gE基因的检出率均为45.9%(17/37),与荧光定量PCR方法检测的符合率为100%。本研究所建立的双重RPA方法反应快速、操作简便、结果可靠,可有效应用于对PRV野毒和疫苗毒的快速鉴别检测。
- 刘立兵刘立兵耿云云王建昌袁万哲
- 关键词：伪狂犬病病毒
- 非洲猪瘟病毒RPA等温检测方法的建立被引量：43
- 2016年
- 为建立一种简单、快速的非洲猪瘟病毒（ASFV）分子检测方法,基于ASFV P72基因保守序列,设计并合成引物,建立了一种ASFV重组酶聚合酶扩增（RPA）等温检测方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,即可实现对目的片段的有效扩增;以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板,RPA的检测限达到10～2 copies,同世界动物卫生组织（OIE）推荐的实时荧光PCR方法检测限一致,但比OIE推荐方法的检测限高10倍;RPA仅特异性扩增ASFV P72基因,对FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组c DNA或DNA没有扩增。本研究所建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠,为非洲猪瘟的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。
- 王建昌王金凤刘立兵孙晓霞袁万哲
- 关键词：非洲猪瘟病毒分子检测
