倪娜娜
- 作品数：9 被引量：9H指数：2
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 靶向调控皮肤恶性黑素瘤潜在致病基因CCL18的miRNA预测及表达相关性分析被引量：1
- 2017年
- 目的 探讨靶向调控皮肤恶性黑素瘤潜在致病基因CCL18的miRNA。方法 用miRanda和TargetScan在线软件进行生物信息学分析，预测靶向调控CCL18基因的miRNA。根据人基因序列分析构建CCL18基因3＇UTR双荧光素酶报告载体及miRNA载体，共转染293T细胞48 h后裂解细胞并检测荧光素酶活性。其中，CCL18基因3＇UTR双荧光素酶报告载体分3＇UTR突变型组、3＇UTR野生型组和空白对照组，miRNA载体携带筛选的miRNA。应用实时荧光定量PCR检测14例黑素瘤新鲜组织及瘤旁正常皮肤组织（对照）中CCL18和筛选miRNA的表达，并对其相关性进行分析。结果 在线软件分析显示，CCL18、3＇UTR具有miR、183、miR、128、miR、33a等miRNA的作用靶点。成功构建荧光素酶报告载体及miRNA载体，荧光素酶活性检测显示，miR、183、miR、128的3＇UTR突变型组荧光素酶表达量（11.63 ± 0.42；8.80 ± 0.49）明显高于3＇UTR野生型组（4.86 ± 0.39；5.01 ± 0.54）及空白对照组（2.41 ± 0.13；2.39 ± 0.05），差异有统计学意义（均P 〈 0.01），而miR、33a的3＇UTR突变型组荧光素酶表达量与3＇UTR野生型组差异无统计学意义（6.41 ± 0.47比6.16 ± 0.22，P 〉 0.05）。实时荧光定量PCR显示，14例黑素瘤肿瘤组织中CCL18基因的相对表达量（3.52 ± 1.68）高于对照组织，而miR、183（0.49 ± 0.32）、miR、128（0.30 ± 0.20）、miR、33a（0.46 ± 0.40）的相对表达量均低于对照组织。CCL18表达水平与miR、128表达水平呈负相关（rs = 、0.548，P 〈 0.05），而与miR、183、miR、33a表达水平无相关性（P 〉 0.05）。结论 miR、128可能参与调控皮肤恶性黑素瘤潜在致病基因CCL18。
- 宋昊布文博倪娜娜温斯健熊竞舒戚金亮徐秀莲孙建方
- 关键词：黑色素瘤微RNAS
- Cbl-b 基因沉默对小鼠原代淋巴细胞免疫活性影响的研究
- 2016年
- 目的：体外初步研究 Cbl-b 基因经特异性 siRNA 沉默后对小鼠淋巴细胞免疫活性的影响。方法摘取 C57BL/6小鼠的脾脏，体外无菌分离小鼠脾脏淋巴细胞后进行培养。通过 Entranster^TM-R4000试剂将 Cbl-b siRNA 转染入小鼠原代淋巴细胞以沉默细胞内 Cbl-b 的表达。转染72 h 后通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测淋巴细胞培养上清中干扰素γ（INF-γ）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达量。通过与 B16F10黑素瘤细胞共培养，研究 Cbl-b 基因沉默后的淋巴细胞对 B16F10黑素瘤细胞免疫杀伤活性的影响。结果 Cbl-b siRNA 成功转染进小鼠原代淋巴细胞并能有效沉默细胞内 Cbl-b 的表达。与阴性对照转染组及空白组相比，转染 Cbl-b siRNA 的淋巴细胞 IFN-γ、TNF-α分泌量增加（P 〈0.05）。共培养检测结果显示，Cbl-b siRNA 转染组比转染阴性对照组能更高效地杀伤小鼠 B16F10细胞。结论 Cbl-b 基因沉默能够促进小鼠淋巴细胞 INF-γ、TNF-α分泌能力，并能增强淋巴细胞对 B16F10黑素瘤细胞的体外免疫杀伤作用。
- 胡彬倪娜娜吕雅琳陈浩刘毅孙建方
- 关键词：黑色素瘤基因沉默小鼠淋巴细胞免疫活性CBL-B
- 组氨酸三聚体核苷结合蛋白1在黑素瘤组织中的表达及其基因启动子甲基化水平研究被引量：2
- 2016年
- 目的：检测组氨酸三聚体核苷结合蛋白1（HINT1）在黑素瘤中的表达和HINT1基因启动子甲基化状态，探讨HINT1启动子甲基化与临床病理参数的关系。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）法检测56例黑素瘤及瘤旁组织和51例色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化水平，免疫组化法检测56例黑素瘤和51例色素痣组织中HINT1蛋白的表达。结果 MSP显示，黑素瘤组织、瘤旁组织及色素痣组织中HINT1基因启动子区甲基化率分别为76.8%（43/56）、33.9%（19/56）和35.3%（18/51），黑素瘤组HINT1基因启动子区甲基化率明显高于瘤旁组织组和色素痣组，且差异有统计学意义（χ2=20.810、18.749，均P〈0.05），瘤旁组织组与色素痣组间差异无统计学意义（χ2=0.022，P〉0.05）。免疫组化显示，56例黑素瘤和51例色素痣组织中分别有12例（21.4%）和42例（82.4%）HINT1蛋白阳性表达，两组阳性率差异有统计学意义（χ2=39.633，P〈0.01）。12例HINT1蛋白阳性的黑素瘤组织中，有6例HINT1基因启动子甲基化，而在44例HINT1蛋白阴性的癌组织中HINT1启动子甲基化率高达84.1%（37/44），两组差异有统计学意义（χ2=6.147，P=0.013）。56例黑素瘤中，HINT1基因启动子区甲基化率在Clark分级Ⅰ~Ⅱ级组（59.1%，13/22）与Ⅲ~Ⅴ级组（88.2%，30/34）间差异有统计学意义（χ2=6.365，P=0.012）。结论 HINT1在黑素瘤组织中低表达，其机制可能与启动子区发生高甲基化有关；HINT1启动子区高甲基化可能参与黑素瘤的发生及发展。
- 温斯健倪娜娜张韡宋昊王小坡邵雪宝李阿梅程伟孙建方
- 关键词：黑色素瘤甲基化
- PKCI-1／HINT1表达质粒的构建及其对黑素瘤A375细胞凋亡及自噬影响的初步研究
- 2016年
- 目的 构建人PKCI-1/HINT1基因的真核表达质粒,研究其在人黑素瘤A375细胞株中的表达并检测其对A375细胞凋亡及自噬的影响.方法 以人黑素瘤细胞A375的总RNA为模板,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增PKCI-1/HINT1基因序列,将PKCI-1/HINT1基因克隆到真核表达载体PCDNA3.1（＋）中,构建PCDNA3.1（＋）-PKCI-1/HINT1重组体.将PCDNA3.1（＋）-PKCI-1/HINT1表达载体瞬时转染黑素瘤A375细胞,RT-PCR及Western印迹检测PKCI-1/HINT1在细胞内的表达,并以PCDNA3.1（＋）空载体转染细胞作为相应对照组.噻唑蓝（MTT）检测PKCI-1/HINT1转染后细胞的增殖变化,Hoechest 33258染色检测细胞凋亡,采用绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3（GFP-LC3）标记结合激光共聚焦显微镜法检测PKCI-1/HINT1对细胞自噬的的影响,并通过Western印迹检测PKCI-1/HINT1对细胞内caspase 3及自噬相关蛋白beclin1蛋白表达的影响.结果 PCDNA3.1 （＋）-PKCI-1/HINT1真核表达载体经酶切及测序鉴定构建成功,并能够在细胞内有效表达.MTT检测发现PKCI-1/HINT1能够明显抑制A375细胞的增殖,与PCDNA3.1（＋）对照组相比,在48 h,72 h及96 hPCDNA3.1 （＋）-PKCI-1/HINT1组活细胞数分别减少17.0％,25.6％、29.4％,差异有统计学意义（均P＜0.05）.Hoechest 33258染色显示PKCI-1/HINT1可促进A375细胞内凋亡小体形成.激光共聚焦显微镜发现PKCI-1/HINT1的过表达可使A375细胞内GFP-LC3B的点状聚集增加.Western印迹发现,PKCI-1/HINT1可促进细胞内caspase 3及beclin1蛋白表达.结论 成功构建真核表达载体PCDNA3.1 （＋）-PKCI-1/HINT1并在细胞内有效表达PKCI-1/HINT1.PKCI-1/HINT1的高表达可以抑制A375细胞增殖,促进其凋亡,同时可引发A375细胞的自噬过程.
- 倪娜娜温斯健张韡姜祎群孙建方
- 关键词：黑色素瘤细胞系自噬
- Cbl-b基因shRNA干扰载体的构建及鉴定被引量：3
- 2015年
- 目的 构建小鼠Cbl-b基因RNA干扰（RNAi）的真核表达质粒,并初步鉴定其干扰效果,为后续研究Cbl-b在黑素瘤免疫治疗中的作用奠定基础.方法 根据基因库提供的Cbl-b cDNA序列,设计并合成4对短发夹结构的互补DNA序列,克隆至载体PGPU6/GFP/Neo构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定.重组干扰质粒构建成功后,将干扰质粒与Cbl-b过表达载体共转染293T细胞,于转染后48 h,通过实时荧光定量PCR法及蛋白质印迹法检测各质粒对Cbl-b基因的表达抑制效应.结果 测序分析证实,4对shRNA寡核苷酸序列分别成功插入至shRNA真核表达载体PGPU6/GFP/Neo中,将构建成功的PGPU6/GFP/Neo-shRNA质粒与Cbl-b真核表达载体共转染细胞48 h后,通过荧光实时定量PCR法及Western印迹测定,发现4条shRNA序列对Cbl-b的表达均有一定的抑制效应,其中以1号shRNA序列重组质粒对Cbl-b表达的抑制程度最高（P＜0.05）.结论 成功构建并筛选出沉默效应最高的Cbl-b shRNA真核细胞表达载体.
- 胡彬倪娜娜吕雅琳陈浩刘毅孙建方
- 关键词：黑色素瘤
- 早期蕈样肉芽肿微小RNA表达谱的研究
- 2016年
- 目的：筛选与早期蕈样肉芽肿（MF）相关的微小RNA（miRNA ）。方法用高通量miRNA PCR芯片检测6例早期MF与6例湿疹和扁平苔藓皮损中miRNA的表达差异。针对差异表达的miRNA，进行13例早期MF、13例湿疹和扁平苔藓皮损组织及Myla细胞株的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证。结果芯片结果示，相对于对照组，早期MF hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-302c-3p显著高表达，差异有统计学意义（P〈0.05）。皮损组织的RT-qPCR验证结果与芯片结果一致。与正常人外周血T淋巴细胞相比，Myla细胞株中hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-107显著上调，与芯片结果一致；未见hsa-miR-302c-3p的差异性表达。结论与炎症性皮肤病相比，早期MF存在差异表达的miRNA表达谱。
- 王光平倪娜娜周晓伟杨莹宋昊温斯健陈浩徐秀莲孙建方
- 关键词：微小RNAS芯片分析技术基因表达蕈样肉芽肿
- Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株被引量：1
- 2016年
- 目的构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定，转染人黑素瘤细胞A375，使其过表达RhoD蛋白，为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础。方法Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体，经PCR及基因测序鉴定后，与辅助质粒pLV／helper-SL3，pLV／helper—SIA及pLV／helper—SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine2000复合物，并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装，产生相应慢病毒颗粒，通过定量PCR方法测定病毒滴度。包装好的慢病毒转染人黑素瘤A375细胞，荧光显微镜下观察荧光表达情况，流式细胞仪检测转染效率；实验分为A375（未处理对照组）、A375-EGFP（不含目的基因的空病毒对照组）和A375-RhoD（含RhoD基因的病毒组）三组，采用实时荧光定量PCR（QPCR）及免疫印记法（western blotting，WB）验证耽扣在A375-RhoD组细胞中的过表达。结果通过PCR、基因测序证实，慢病毒表达载体pLV[Exp]-EGFP／Neo—CMV〉hRhoD构建成功。与辅助质粒共转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒，经测定病毒滴度为（5．13±2）×10^8TU／mL。转染A375细胞后可见明显的绿色荧光表达，流式检测转染效率大于80％;A375-RhoD组RhoDmRNA及蛋白水平均较A375-EGFP组和A375组细胞中明显增高。结论成功构建RhoD慢病毒表达载体，包装出具高效感染力的慢病毒颗粒并成功转染人黑素瘤A375细胞，为进一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供实验基础。
- 温斯健倪娜娜周晓伟吴琼王小坡宋昊张韡孙建方
- 关键词：慢病毒GATEWAY技术A375
- 泛素连接酶Cbl—b基因短发卡RNA慢病毒载体构建及其对A375细胞生物学行为的影响被引量：1
- 2018年
- 目的 构建人泛素连接酶Cbl-b基因短发卡RNA（shRNA）重组慢病毒载体，探讨其对人黑素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法 设计并合成3条沉默Cbl-b 基因的特异性shRNA及1条阴性对照shRNA，构建慢病毒载体。将A375细胞分成5组，即分别用3条特异性shRNA转染的CBLB-shRNA-1组、CBLB-shRNA-2组、CBLB-shRNA-3组，阴性对照组（阴性对照shRNA转染），空白对照组（转染空载体）。应用实时荧光定量PCR和Western印迹检测转染后72 h各组A375细胞沉默效率；CCK8法检测转染后24、48、72及96 h细胞增殖能力；流式细胞仪检测转染后72 h细胞凋亡情况、细胞周期，Transwell法检测转染后72 h细胞侵袭能力。结果 成功构建3条Cbl-b shRNA慢病毒载体，Western印迹示CBLB-shRNA-3蛋白沉默效率最高。CCK8检测表明，CBLB-shRNA-3组A375细胞增殖能力在转染后72 h和96 h较阴性对照组、空白对照组明显降低（均P 〈 0.01）。流式细胞仪检测示，CBLB-shRNA-3组凋亡率［（22.73 ± 6.58）%］明显高于阴性对照组［（6.08 ± 1.35）%］和空白对照组［（6.34 ± 1.07）%，均P 〈 0.01］。CBLB-shRNA-3组G1期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组（P 〈 0.01），而S期细胞比例明显低于阴性对照组和空白对照组（P 〈 0.01）。Transwell检测示，阴性对照组、空白对照组和CBLB-shRNA-3组转染后72 h时穿膜细胞数分别为76.60 ± 1.82、73.20 ± 3.83、19.60 ± 1.14，差异有统计学意义（F = 794.50，P 〈 0.01）。结论 成功构建能高效沉默Cbl-b蛋白的CBLB-shRNA-3重组shRNA慢病毒载体，其可促进A375细胞凋亡，抑制A375细胞增殖、细胞周期进程和侵袭能力。
- 王小坡倪娜娜熊竞舒宋昊姜祎群陈浩曾学思孙建方
- 关键词：A375细胞短发卡RNA
- CXCL12对人黑素瘤细胞株M14生物学行为的影响被引量：1
- 2016年
- 目的:明确CXCL12对人黑素瘤细胞株M14体外增殖、迁移、侵袭的影响。方法:用不同浓度的CXCL12(0、10、50、100、200 ng/mL)刺激或诱导人黑素瘤细胞株M14,CCK8法检测细胞增殖,Transwell迁移和侵袭试验检测细胞迁移和侵袭能力。用100 ng/mL的CXCL12处理人黑素瘤细胞株M14,Western blot法检测处理后不同时间点(0、5、10、20、30、60 min)的ERK、p-ERK、AKT、p-AKT的表达。结果:CXCL12能够增强人黑素瘤细胞株M14细胞的体外增殖、迁移、侵袭能力,以及促进ERK、AKT信号通路的激活。结论:CXCL12可能与黑素瘤的进展过程相关。
- 杨莹倪娜娜王光平温斯健宋昊崔盘根孙建方
- 关键词：黑色素瘤CXCL12
