王鲲
- 作品数：9 被引量：22H指数：3
- 供职机构：兰州军区兰州总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金甘肃省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 构建急进高海拔地区急性应激性胃肠道损伤大鼠模型被引量：2
- 2015年
- 背景:前急进高海拔地区胃肠道急性应激损伤的模型建立鲜有报道,建立稳定的急进高海拔肠应激性损伤模型成为当前研究急进高海拔应激性胃肠损伤及相关疾病的前提。目的:建立急进高海拔引起的急性应激性肠缺血再灌注大鼠模型。方法:将雄性Wistar大鼠24只按随机数字表法分为3组,高海拔下限正常对照组、高海拔假手术组和高海拔缺血再灌注组各8只。大鼠急进海拔地区,缺血再灌注组以血管夹夹闭肠系膜上动脉根部完全阻断血流60 min,之后松开动脉血管夹,恢复肠道血流形成再灌注,时间为60 min。假手术组仅分离肠系膜上动脉不作夹闭。正常对照组不作任何处理。大鼠再灌注60 min后,以化学发光法检测肌酸激酶同工酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐水平,并行病理组织学观察分析。结果与结论:急进高海拔并行肠缺血再灌注对大鼠肝、肾、心功能均有不同程度的损伤,肠黏膜出血,腺体断裂甚至发生溶解,黏膜层和黏膜固有层有大量炎性细胞浸润。提示采用急进高海拔地区后动脉夹夹闭肠系膜上动脉的方法制备急进高海拔地区急性应激性胃肠道损伤的大鼠模型病情相对稳定,方法简单,适于进行急进高海拔地区急性应激性胃肠道损伤的防治研究。
- 杨志华王鲲哈小琴张萍
- 关键词：应激缺血再灌注
- 低氧诱导因子-1α和角质细胞生长因子双基因重组减毒沙门菌菌株的构建及其在肠上皮细胞中的表达被引量：3
- 2013年
- 目的构建同时携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体的减毒沙门菌菌株(Ty21a-pIRES-HIF-IRES-KGF,TPHK),观察其在防治肠黏膜损伤方面潜在的应用前景。方法采用RT-PCR法从低氧处理A549细胞扩增HIF-1αcDNA后连接到载体pIRES-SEQ的NheI和MluI酶切位点,构建单基因重组质粒pIRES-HIF。然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板扩增KGF基因并克隆到重组质粒pIRES-HIF的XbaI和NotI酶切位点上,获得双基因重组质粒pIRES-HIF-IRES-KGF。采用电穿孔法将pIRES-HIF-IRES-KGF质粒转入减毒沙门菌Ty21a中,通过筛选获得TPHK。该菌株转染肠上皮细胞IEC-6后48 h,用ELISA法检测上清中HIF1α和KGF的表达水平。并采用MTT方法分析不同剂量表达产物对IEC-6细胞的作用。结果通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实TPHK构建成功。TPHK转染正常肠上皮细胞IEC-6后,48 h取上清用ELISA法检测HIF和KGF的表达,结果表明6×105个细胞可表达(16.03±1.47)ng的HIF蛋白和(17.77±1.83)ng的KGF蛋白。MTT结果表明表达上清有明显刺激正常肠上皮细胞IEC-6增殖的活性(P<0.05),加入20%表达上清时刺激活性达高峰。结论成功构建了TPHK,其可有效转染肠上皮细胞IEC-6,表达上清可显著促进IEC-6细胞增殖。提示TPHK具有潜在的在肠黏膜损伤局部应用的前景。
- 哈小琴李晓云邓芝云董菊子赵勇王鲲张媛媛张俊杨志华
- 关键词：低氧诱导因子-1Α角质细胞生长因子减毒沙门菌
- 人脐带间充质干细胞体外培养、鉴定及其诱导分化的研究被引量：6
- 2013年
- 目的通过体外分离、培养及鉴定人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs),探讨其多向分化潜能。方法取正常足月新生儿脐带,采用组织贴壁培养法分离原代hUCMSCs,观察细胞生长形态。采用流式细胞仪技术检测hUCMSCs细胞表型及细胞周期。通过成神经细胞诱导和成脂肪细胞诱导,鉴定hUCMSCs的多向诱导分化能力。结果成功分离和培养hUCMSCs原代细胞,经流式细胞仪鉴定高表达间质细胞标志CD44和CD105,阳性率为96.73%和96.10%,整合素受体CD29阳性率为99.53%;低表达造血系标志CD34和CD45阳性率为0.80%和1.91%,人白细胞抗原HLA-DR阳性率为1.41%。细胞周期检测hUCMSCs主要处于G0/G1期。hUCMSCs成神经细胞诱导,出现神经元样细胞;免疫组化检测神经巢蛋白(Nestin)呈阳性表达。hUCMSCs成脂肪细胞诱导,出现空泡样脂肪滴,油红O染色可见脂质沉积。结论 hUCMSCs具有多向分化潜能,可跨胚层诱导分化为多种组织类型的细胞。
- 王晓辉惠玲杨霄鹏王鲲杨雯哈小琴
- 关键词：间质干细胞脐带细胞分化
- Notch1对人脐带间充质干细胞增殖、黏附及迁移影响的体外研究被引量：3
- 2013年
- 目的探讨Notch1基因的重组腺病毒转染对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)增殖、黏附及迁移能力的影响。方法按照不同腺病毒感染hUCMSCs分为实验组(AdNotch1)、阴性对照组(Ad-GFP)与空白对照组。以最佳MOI转染hUCMSCs,观察细胞形态变化以及GFP蛋白的表达。比较3组细胞增殖能力、细胞周期、黏附能力及迁移能力。Western Bolt检测3组细胞Notch1蛋白的表达水平。结果荧光下观察腺病毒成功感染细胞,阴性对照组和实验组均出现了GFP的表达,且随培养时间的延长表达量增高,可见光下观察实验组细胞增殖速度较快。实验组细胞的增殖能力(48、72、96 h)、黏附能力(12、16、20 h)及迁移能力均较阴性对照组及空白对照组增强(P<0.05)。Western Bolt检测实验组细胞Notch1蛋白的表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。结论 Notch1能明显促进hUCMSCs的增殖、黏附和迁移。
- 王晓辉罗芸贾庆华杨霄鹏王鲲哈小琴
- 关键词：间质干细胞脐带NOTCH1细胞黏附细胞运动
- 人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化及其相关基因鉴定被引量：2
- 2014年
- 目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离提取、体外诱导分化为脂肪细胞的能力及其相关基因的表达情况。方法:取新生儿脐带经组织培养法提取后分离培养于αMEM完全培养基中,经大量纯化与扩增后,采用倒置显微镜观察其形态与细微结构;流式技术检测其细胞周期及表面标志;以含有成脂诱导剂的αMEM培养基对P3的hUC-MSCs进行培养,诱导其向脂肪细胞方向分化,对其对诱导后的细胞进行检测。应用油红"O"染色对其进行定性鉴定;应用实时定量RT-PCR对LPL、Leptin的基因含量进行测定。结果:经过组织培养法后,细胞呈贴壁生长,细胞呈梭性或旋涡状,形态不规则,多数有凸起,细胞核较大,核仁明显;第7代以前的细胞具有较强的生长活性;流式技术检测发现此类细胞高表达CD44、CD73和CD105等细胞表面标记,而几乎不表达CD34、CD45、CD31和HLA-DR。培养至第3代的细胞约72.724%的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069%,第7代时G1期细胞约为83.875%、S期为9.606%左右;经成脂诱导剂诱导分化后,细胞经油红"O"染色,分化为脂肪细胞的细胞着色并呈红色,实时定量RT-PCR结果显示该部分细胞表达脂肪细胞的标志性基因LPL和Leptin。结论:P7以前的hUC-MSCs具有较强的生长分化能力,可以向脂肪细胞进行分化并表达一定量的特定标志性基因。
- 杨雯惠玲吕同德闫蔚王鲲
- 关键词：人脐带间充质干细胞体外诱导脂肪细胞基因鉴定
- 低氧诱导因子和角质细胞生长因子双基因重组腺病毒的构建及其在肺泡上皮细胞中的表达
- 2013年
- 目的:构建同时携带低氧诱导因子-lα(HIF-lα)和角质细胞生长因子(KGF)的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIF-KGF),观察其在防治肺损伤潜在的应用前景。方法:低氧处理A549细胞后提取总RNA并逆转录为cDNA作为模板,依据GeneBank公布的HIF-1αcDNA设计引物,并分别引入KpnI和BamHI酶切位点,PCR扩增后将目的基因HIF-1α连接到载体pShuttle-CMV-EGFP上,构建重组质粒pShuttle-GFP-HIF。然后以质粒pIRES2-EGFP-KGF为模板,用引入NheI和PmeI酶切位点的引物PCR扩增KGF基因并克隆到重组质粒pShuttle-GFP-HIF上,获得穿梭质粒重组质粒pShuttle-GFP-HIF-KGF。采用细菌内重组方法将目的序列重组到pAdxsi病毒骨架载体上构建携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF。检测重组腺病毒滴度后,转染人肺泡上皮细胞A549,检测目的基因的转染表达。结果:通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带HIF-lα和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF构建成功,且构建的重组腺病毒纯度好、滴度高。用pAdxsi-GFP-HIF-KGF以100 MOI转染A549细胞后24h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48h时荧光更强;转染48h ELISA法检测培养上清中HIF-1蛋白表达水平为(56.36±4.53)ng/mL,KGF蛋白表达水平为(60.20±2.92)ng/mL。结论:成功构建了腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其转染效率及目的基因的蛋白表达水平较高,具有潜在的进一步在肺损伤局部应用的前景,为后期制备可以同时发挥KGF、HIF-1作用的基因治疗药物打下基础,同时为高海拔地区应激性急性肺损伤的有效防治提供实验基础。
- 哈小琴姜东红邓芝云董菊子赵勇彭俊华张玉张玉琴王鲲
- 关键词：低氧诱导因子-1Α角质细胞生长因子基因腺病毒
- 双基因重组腺病毒表达载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF的构建及表达
- 2013年
- 目的:构建同时携带低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和角质细胞生长因子(KGF)的腺病毒载体(pAdxsi-GFP-HIFKGF),观察其在A549中的表达。方法:从低氧处理A549细胞中PCR扩增HIF-1αcDNA,并连接到载体pShuttle-CMVEGFP上得到重组质粒pShuttle-GFP-HIF,同时将从质粒pIRES2-EGFP-KGF扩增的KGF基因也克隆其上,获得穿梭重组质粒pShuttle-GFP-HIF-KGF。再将其重组到pAdxsi病毒骨架载体上,构建携带HIF-1α和KGF双基因的重组腺病毒载体。观察重组腺病毒转染A549细胞后表达情况。结果:证实携带HIF-lα和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi-GFPHIF-KGF成功构建。其转染A549细胞后可有效表达HIF-1和KGF蛋白,48 h时HIF-1蛋白表达水平为(56.36±4.53)ng/ml,KGF蛋白表达水平为(60.20±2.92)ng/ml。结论:成功构建了双基因腺病毒载体pAdxsi-GFP-HIF-KGF,其可有效转染表达,具有进一步在肺损伤防治应用的前景。
- 哈小琴王鲲张玉邓芝云董菊子赵勇彭俊华
- 骨髓间充质干细胞移植修复高原大鼠股骨缺损被引量：5
- 2014年
- 背景:对于高原地区受到环境负面影响的组织创伤,例如高原骨缺损,干细胞的特点可以提供一个良好的加速创伤修复的方法。目的:研究骨髓间充质干细胞治疗大鼠高原股骨缺损的创伤恢复效果。方法:分离提取雄性Wistar大鼠原代骨髓间充质干细胞,取第3代细胞进行细胞表型鉴定。雌性Wistar大鼠80只,制备实验性股骨圆形缺损后随机均分为平原对照组、平原骨髓间充质干细胞移植组、高原对照组、高原骨髓间充质干细胞移植组(n=20)。治疗后第30天拍X射线片观察股骨缺损区的修复情况,并于第10,20,30天分别采集股骨缺损区组织,检测其中碱性磷酸酶的含量。结果与结论:高原骨髓间充质干细胞移植组大鼠股骨缺损区愈合速度较高原对照组快,且碱性磷酸酶的含量较高原对照组高(P<0.05);平原骨髓间充质干细胞移植组的缺损区愈合速度也比平原对照组快,且碱性磷酸酶的含量也较平原对照组高(P<0.05)。平原骨髓间充质干细胞移植组的缺损区愈合速度较高原骨髓间充质干细胞移植组快,且碱性磷酸酶的含量较高原骨髓间充质干细胞移植组高(P<0.05)。说明骨髓间充质干细胞的局部移植可提高高原股骨缺损区局部的碱性磷酸酶含量,加速缺损区的创伤修复速度,但高原股骨缺损区的愈合修复较平原组慢。
- 王鲲伏小平杨志华郑英高瞻高彩艳买超平哈小琴
- 关键词：骨髓间充质干细胞移植WISTAR大鼠股骨缺损碱性磷酸酶骨缺损区愈合速度
- 冠心病患者外周血内皮祖细胞数量及生物学功能与肝细胞生长因子的关系被引量：2
- 2013年
- 目的观察冠心病患者外周血内皮祖细胞（EPCs）数量及生物学功能的变化，进一步探讨肝细胞生长因子（HGF）对其影响，为临床应用HGF提供理论依据。方法收集50例非冠心病患者（对照组）、50例冠心病患者（冠心病组；每例分为HGF干预组和非HGF干预组）外周血，应用流式细胞仪和ELISA法分别检测各组CD133＋／CD34＋细胞的数量和HGF水平；采用密度梯度离心法分离培养各组外周血中EPCs，通过MTT法、Transwell迁移试验、黏附能力测定试验及PI—AnnexinV双重染色法来分别检测EPCs的增殖、迁移、黏附能力和凋亡水平。结果与对照组比较，冠心病组外周血中CD133＋／CD34＋细胞数量减少[（2．15±0．69）％1）S（5．26±1．16）％，P〈0．011，血浆中HGF浓度升高[（6．80±1．22）w（2．62±0．83）gg／L，P〈0．01]，EPCs增殖、迁移、黏附等生物学功能减弱（P〈0．05）；HGF干预组EPCs增殖、迁移、黏附等生物学功能显著改善（P〈0．05）。各组细胞凋亡水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论外周血中CD133＋／CD34＋细胞数量和血浆中HGF水平的变化可能成为冠心病患者新的危险评估因素。
- 邓芝云董菊子赵勇彭俊华李晓云王鲲
- 关键词：冠心病内皮祖细胞肝细胞生长因子
