韩芦芦
- 作品数：9 被引量：25H指数：4
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- miR-429靶向调控IKKβ对神经母细胞瘤细胞增殖、侵袭和转移的影响被引量：1
- 2020年
- 目的探讨微小RNA-429(micro RNA-429,miR-429)对神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞增殖、侵袭和转移的影响,及其在NB细胞中对IKKβ是否有调控作用及其调控机制。方法选择2016年6月至2018年6月青岛大学附属医院小儿外科术中切除的NB原发肿瘤组织和瘤旁正常组织。采用RT-PCR检测NB组织和正常对照组织中miR-429的表达水平;RT-PCR检测miR-429在NB细胞SH-SY5Y、SK-N-SH和对照细胞HUVEC中的表达情况;在SH-SY5Y和SK-N-SH中抑制miR-429的表达,采用细胞集落形成实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验和流式细胞术检测NB细胞增殖、侵袭和转移能力的变化;在SH-SY5Y和SK-N-SH中过度表达miR-429,采用细胞集落形成实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验和流式细胞术检测NB细胞增殖、侵袭和转移能力的变化;基因软件预测miR-429的靶基因并用荧光素酶报告实验进行验证;过度表达miR-429,采用RT-PCR和Western blot检测其对NF-κB通路下游基因cyclinD1、IL-8、Bcl2的影响,并用MTT检测过表达IKKβ后,miR-429对NB细胞抗肿瘤作用影响的变化。结果RT-PCR检测显示miR-429在NB组织中的表达为0.46±0.08,明显低于对照组织1.11±0.12,且差异有统计学意义(P<0.05);miR-429在SH-SY5Y和SK-N-SH中的表达分别为0.37±0.06和0.45±0.08,明显低于HUVEC中的1.07±0.11,且差异有统计学意义(P<0.01)。抑制miR-429表达后,RT-PCR显示miR-429 mRNA在SH-SY5Y和SK-N-SH分别为0.42±0.07和0.27±0.03,与对照组相比抑制作用明显(P均<0.01)。抑制miR-429表达后,细胞集落形成实验显示,SH-SY5Y和SK-N-SH细胞集落形成分别为(255±6)个和(275±9)个,明显高于对照组(67±2)个和(82±3)个,且差异有统计学意义(P均<0.01);细胞划痕实验显示,SH-SY5Y和SK-N-SH细胞的愈合率分别为55%和61%,较对照组25%和36%高,且差异有统计学意义(P均<0.05);细胞侵袭实验显示,SH-SY5Y和SK-N-SH细胞侵袭数量分别为(74±2)个和(96±4)个,与对照组(34±1)个和(4
- 周显军房丹韩芦芦李富江郝希伟姜忠陈鑫
- 关键词：神经母细胞瘤微小RNA
- miR-7-5p靶向调控POLE4对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y体外增殖和侵袭的影响研究被引量：6
- 2019年
- 目的探讨微小RNA-7-5p(microRNA-7-5p,miR-7-5p)对POLE4蛋白[Polymerase (DNA-directed), epsilon 4,POLE4]的调控作用及其对神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞SH-SY5Y体外增殖、侵袭的影响。方法利用生物信息学软件预测miR-7-5p的靶基因为POLE4;运用荧光素酶实验验证miR-7-5P对POLE4的直接靶向作用。将SH-SY5Y细胞分为miR-7-5p过表达实验组(miR-7-5p组)、阴性对照组和空白对照组并进行细胞转染,运用RT-PCR、Western Blot实验检测转染后的SH-SY5Y细胞中POLE4 mRNA和蛋白的表达量,然后通过克隆形成实验和Transwell小室法检测转染后的SH-SY5Y细胞的体外增殖活力和侵袭能力的变化。结果运用TargetScan、PicTar和miRanda软件预测miR-7-5p的靶基因为PLOE4。RT-PCR和Western Blot实验显示,miR-7-5p组中POLE4 mRNA和POLE4蛋白的相对表达量分别为0.53±0.04和0.26±0.02,与阴性对照组和空白对照组相比,表达水平均下调明显,且差异有统计学意义(P均<0.05)。说明miR-7-5p能够显著抑制POLE4 mRNA和POLE4蛋白的表达。过表达miR-7-5p后,miR-7-5p组集落形成数为(87±3)个,较阴性对照组(138±3)个和空白对照组(156±4)个明显减少,且差异有统计学意义(P<0.05)。说明miR-7-5p可以下调神经母细胞瘤细胞的增殖活力。Transwell小室检测实验发现,miR-7-5p组穿透基质胶的细胞数为(82±5)个,较空白对照组(349±9)个和阴性对照组(232±5)个明显减少,且差异有统计学意义(P<0.05)。说明miR-7-5p对SH-SY5Y细胞的侵袭能力有明显抑制作用。结论miR-7-5p通过靶向抑制POLE4的表达进一步抑制NB细胞的增殖和侵袭能力,可能作为抑制NB细胞增殖和转移的潜在靶点。
- 刘志洋董蒨韩芦芦郝希伟李富江陈鑫
- 关键词：神经母细胞瘤
- miR-93对神经母细胞瘤细胞侵袭和迁移的影响及机制研究被引量：10
- 2015年
- 目的研究miR-93对神经母细胞瘤细胞侵袭和迁移能力的影响及可能的分子机制。方法收集13例确诊的神经母细胞瘤患儿原发部位和转移部位组织样本，利用实时定量PCR的方法检测样本中miR-93的表达水平。在神经母细胞瘤细胞SH—SY5Y和SH—N-SH细胞中转染miR-93mimic，转染24h后利用实时定量PCR技术检测SH—SY5Y和SH—N-SH中miR-93的表达水平。利用Transwell侵袭实验检测过表达miR-93后对细胞侵袭能力的影响。利用体外划痕实验检测过表达miR-93对细胞迁移能力的影响。利用Western blot方法检测过表达miR-93mimic后SH—SY5Y和SH-N-SH细胞中MYCN蛋白表达水平。在Targetscan中找出可能与miR-93作用的MYCN的3’UTR序列，设计合成野生型与突变型MYCN的3’UTR的PCR引物，构建野生型与突变型荧光素酶报告载体，用X-tremeGENE将荧光素酶报告载体分别与miR-93mimic共转染到SH—SY5Y细胞中，用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性，验证miR-93对MYCN的靶向调控作用。结果与原发性神经母细胞瘤相比，miR-93在转移瘤中表达显著降低。过表达miR-93后SH—SY5Y和SH—N-SH细胞侵袭和迁移能力显著降低。过表达miR-93后，SH-SYSY和SH-N-SH细胞内MYCN蛋白表达下调。荧光素酶活性检测表明miR-93能够抑制MYCN的荧光素酶活性。结论MiR-93能够通过负调控MYCN而抑制神经母细胞瘤细胞侵袭和迁移能力。
- 陈鑫韩芦芦姜忠郝希伟段于河张虹董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤肿瘤转移荧光素
- 前动力蛋白Prokineticin-1对神经母细胞瘤QDDQ-NM细胞VEGF表达的影响
- 2012年
- 目的探讨前动力蛋白（prokineticin-1，Prok-1）对神经母细胞瘤细胞QDDQ-NM细胞血管生成的影响。方法应用Prok-1蛋白受体基因PKRl小分子干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）转染人神经母细胞瘤QDDQNM细胞，分别用Prok-1、AKT蛋白激酶抑制剂LY294002处理后，采用Westernblot检测AKT蛋白磷酸化水平，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清内血管内皮生长因子（VEGF）的含量。结果Prok-1可激活ATK信号通路，磷酸化AKT蛋白水平升高；同时上调QDDQ-NM细胞VEGF的表达。在Prok-1蛋白激酶抑制剂处理浓度分别为0和100ng／ml时，培养细胞上清VEGF浓度分别为（212±23）pg／ml和（416±43）pg／ml，两者差异有统计学意义（P〈0．01）。而AKT蛋白激酶抑制剂LY^294002可抑制Prok-1上调VEGF的表达。结论Prok1可能通过AKT信号传导途径上调神经母细胞瘤VEGF的表达，促进肿瘤血管形成，进而促进神经母细胞瘤的增殖和转移。
- 陈鑫董蒨鹿洪亭张虹郝希伟姜忠段于河韩芦芦
- 关键词：神经母细胞瘤小分子干扰
- miR-144通过靶定ITGβ1调控神经母细胞瘤的侵袭转移被引量：2
- 2017年
- 目的 本研究旨在探讨miR-144对神经母细胞瘤的侵袭和转移的影响,并探索miR-144是否通过靶定ITGβ1调节神经母细胞瘤的侵袭和转移.方法 利用生物信息学技术预测miR-144的靶基因ITGβ1,应用荧光报告基因检测以及荧光定量PCR、Western Blot实验对靶基因进行验证.在神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-BE分别瞬时转染化学合成的成熟双链miR-144和靶基因敲降质粒及对照质粒,建立过表达miR-144细胞模型和靶基因敲降细胞模型.通过 Transwell侵袭实验和划痕实验检测细胞的体外侵袭和转移能力.结果 Transwell实验结果表明,在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和SK-N-BE中过表达miR-144后,细胞的侵袭数目分别为41±2和55±2,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0.01）.抑制ITGβ1基因的表达后,体外划痕实验结果表明,过表达miR-144后,与对照组相比,SH-SY5Y和SK-N-BE细胞的转移能力分别下降了65.45%和75.41%（P〈0.01）.荧光报告基因检测结果显示过表达miR-144后,含有结合位点的荧光报告质粒的相对荧光量降低了37.11%（P〈0.01）,而将结合位点进行基因突变后miR-144对靶基因的抑制作用消失.过表达miR-144后,与对照组相比,SH-SY5Y和SK-N-BE细胞内的ITGβ1 mRNA水平分别降低了40%和43%,Western Blot检测结果显示,ITGβ1蛋白水平分别降低了39%和40%.结论 miR-144通过靶定ITGβ1基因抑制神经母细胞瘤的侵袭和转移过程.
- 吴翮徐升公红磊韩芦芦陈鑫
- 关键词：神经母细胞瘤
- miR-203靶定CAMTA1基因调控神经母细胞瘤细胞的迁移能力被引量：1
- 2014年
- 目的本研究旨在探讨miR-203在神经母细胞瘤组织中的表达水平及其在神经母细胞瘤细胞迁移过程中的作用机制。方法在神经母细胞瘤细胞中转染miR-203抑制剂，通过Transwell迁移实验研究其对迁移的影响。利用生物信息学技术预测miR-203的靶基因，并应用荧光报告基因检测、实时荧光定量PCR及WesternBlot对靶基因进行验证。采用siRNA干扰技术抑制靶基因CAMTA1的表达，共转染miR-203抑制剂及CAMTA1 siRNA，验证miR-203是否是通过靶基因影响细胞迁移。最后应用荧光定量PCR方法检测原发性和转移性神经母细胞瘤样本中miR-203的表达。结果神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y和SK-N-SH中抑制miR-203表达后，与转染miR抑制剂对照相比，细胞迁移数目分别降低了41．34％和37．86％（P〈0．05）。miR-203能够直接靶向结合CAMTA1mRNA的野生型圳TR，转染miR-203抑制剂后，SH-SY-5Y和SK-N-SH细胞中内源性CAMTA1蛋白表达分别是转染miR阴性对照的2．13和1．78倍。（P〈0．05）。转染过表达CAMTA1质粒，SH-SY-5Y和SK-N-SH细胞迁移数目分别下降了25．27％和19．48％（P〈0．05）。在SH-SY5Y细胞中，同时共转miR-203抑制剂和CAMTA1 siRNA，与单纯转染miR-203抑制剂相比，细胞迁移能力增高了19．37％和（P〈0．05），与单纯转染抑制剂对照组相比，无统计学差异（P〈0．05）。与原发性神经母细胞瘤相比，在转移性神经母细胞瘤中，miR-203表达水平更高（P〈0．05）。结论miR-203与神经母细胞瘤样转移性相关，并且能够通过靶定CAMTAl基因影响神经母细胞瘤细胞的迁移能力。
- 刘志洋刘伟伟孙梅陈鑫韩芦芦董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤RNA小分子干扰
- miR-338—3p对神经母细胞瘤增殖和侵袭的抑制作用被引量：5
- 2013年
- 目的探讨microRNA-338—3p（miR-338—3p）对神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和SK-N-MC增殖、侵袭和迁移能力的影响，miR靶基因的确定及靶基因功能的研究。方法miRNA芯片结果发现miR在神经母细胞瘤中低表达，利用实时定量PCR验证其结果。利用脂质体Lipofectamine TM2000将miR-338—3pmimics和miR-338—3p的反义寡核苷酸链（ASO）以及对照质粒分别瞬时转染SK-N-SH和SK-N-MC两种细胞系，MTT法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力，Transwell实验检测细胞的体外侵袭和迁移能力。利用生物信息学技术预测miR-338—3p的靶基因，并应用EGFP荧光报告载体实验，实时荧光定量P（’R和Westernblot实验对靶基因进行验证。并利用实时定量PCR检测神经母细胞瘤中靶基因的表达。最后，将靶基因的敲降质粒和过表达质粒以及对照空质粒分别瞬时转染细胞，MTT法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力，Transwell实验来检测细胞的体外侵袭和迁移能力。结果实时定量PCR显示与癌旁正常组织相比，miR-338-3p在神经母细胞瘤细胞中低表达（P〈0．01）；癌细胞转染miR-338-3pmimics后，细胞活性、克隆形成能力、侵袭和迁移能力与对照组相比是减弱的（P〈0．01），而在转染了miR-338-3p的AS（3封闭miR-338—3p的表达后，细胞活性、克隆形成能力、侵袭和迁移能力与对照组相比是增强的（P〈0．01）。利用生物信息学方法将RAB14基因作为miR-338—3p的候选靶基因，EGFP荧光报告载体实验显示过表达miR-338—3p可以抑制含有miR-338-3p结合位点的报告载体的荧光量（P〈0．01），而将结合位点的碱基进行突变后miR-338-3p对靶基因3’UTR的抑制作用则消失。实时荧光定量PCR和Westernblot结果表明过表达miR-338-3p可以同时在mRNA和蛋白水平上抑制RAB14的表达（P〈0．01），而用ASO抑制miR-338—3p的表达后RAB14的水平升高（P〈0．01）。实时定量PCR
- 鹿洪亭董蒨陈鑫张虹郝希伟韩芦芦
- 关键词：神经母细胞瘤细胞增殖微RNAS
- miR-34a对神经母细胞瘤细胞生长、侵袭和迁移的影响被引量：5
- 2014年
- 目的 检测miR-34a在原发性和转移性神经母细胞瘤组织中的表达水平,并探讨miR-34a对神经母细胞瘤细胞生长、侵袭和迁移的影响.方法 收集18例神经母细胞瘤患儿（神经母细胞瘤原发部位以及转移部位）,利用实时定量PCR检测miR-34a在原发性和转移性神经母细胞瘤组织中的表达水平.在神经母细胞瘤细胞中瞬时转染miR-34a mimics,利用平板克隆形成实验、MTT、侵袭实验和体外划痕实验检测miR-34a对细胞生长、侵袭和迁移的影响.最后利用Western印迹检测miR-34a对生长以及侵袭迁移相关蛋白表达水平的影响.结果 与原发性神经母细胞瘤组织相比,miR-34a在转移性神经母细胞瘤组织中表达降低.与对照细胞组相比,转染miR-34a mimics的细胞克隆数目降低（SH-SY5Y：24＆#177;3.07比43＆#177;6.29和IMR-32：17＆#177;2.36比37＆#177;5.41）,细胞活性下降,并且细胞侵袭和迁移能力也降低（差异具有统计学意义）.Western结果显示miR-34a抑制CD44、CDK4、CCND1和CCNE2的蛋白水平.结论 miR-34a分别通过降低CD44、CDK4、CCND1和CCNE2的表达水平,而抑制神经母细胞瘤细胞的生长、侵袭和迁移,发挥着肿瘤抑癌基因的作用,提示miR-34a可能作为神经母细胞瘤分子治疗的靶点.
- 潘敏陈鑫张虹韩芦芦鹿洪亭郝希伟董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤肿瘤转移
- miR-195通过靶定RET调控神经母细胞瘤的侵袭被引量：2
- 2015年
- 目的神经母细胞瘤是儿童常见的恶性疾病，转移是致死的主要因素，其中微小RNA（microRNA，miRNA）在该疾病的转移中具有很重要的作用。本研究旨在探索miR-195是否通过RET调节神经母细胞瘤细胞的侵袭。方法在神经母细胞瘤细胞中转染mimicscontrol和miR-195mimics，建立过表达miR-195的细胞模型。通过Transwell侵袭实验研究过表达miR-195对侵袭的影响。利用生物信息学检测miR-195的靶基因，并应用荧光素酶报告基因鉴定其对靶基因31UTR的结合序列。实时定量PCR及western检测过表达miR-195对靶基因mRNA及蛋白的改变。应用siRNA干扰建立抑制靶基因的细胞模型，通过Transwell侵袭实验检测敲减靶基因对侵袭的影响。最后建立恢复靶基因表达的细胞模型，通过Transwell侵袭实验验证能力的恢复。结果在SH-SY5Y和SK-N-SH内，均成功过表达miR-195的相对水平分别为34±1．19和43±1．71，与对照组相比具有显著差异（P〈O．001）。SH—SY5Y过表达miR-195后发生侵袭的细胞数由93±2降至62±1，SK-N-SH过表达miR-195后发生侵袭的细胞数由82±2降至56±5，过表达miR-195后显著抑制细胞侵袭（P〈0．05）；生物信息学检测miR-195能够结合RETmRNA的3’UTR。过表达miR-195显著抑制RET的mRNA和蛋白质水平（P〈O．05）。过表达miR-195显著抑制报告质粒RET3’UTRwT的荧光素酶的相对活性（P〈O．05）。RNA干扰均抑制两种细胞内RET（一个在转化中发生重排的原癌基因，RET原癌基因）的mRNA和蛋白的水平（P〈0．05）。在SH-SY5Y内，敲减RET后发生侵袭的细胞数目由89±2降至62±5，在SK-N-SH中由78±2降至63±1，均具有显著差异（P〈0．05）。在恢复实验中，对照组和实验组发生侵袭的数目分别为84±3、64±9、65±5和82±1，恢复RET表达恢复细胞的侵袭能力。结论miR-195与神经母细胞瘤侵袭能力相关，并且能够通过靶向RET调节神经母细胞瘤�
- 朱永洁陈鑫韩芦芦段于河董蒨
- 关键词：神经母细胞瘤转染
