李加
- 作品数：54 被引量：127H指数：8
- 供职机构：中国食品药品检定研究院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学矿业工程更多>>
- 首批Vero细胞蛋白质标准品的研制
- 2020年
- 目的制备首批Vero细胞蛋白质国家标准品,用于人用狂犬病疫苗Vero细胞宿主残留量检测。方法采用Vero细胞分泌蛋白质为原料,加入蔗糖冻干制成Vero细胞蛋白质国家标准品。本标准品的赋值由两步完成:第一步采用Lowry法对Vero细胞蛋白质标准品原液进行蛋白含量测定;第二步采用酶联免疫法以Vero细胞蛋白质标准品原液绘制标准曲线对标准品进行蛋白含量赋值。随机选取16支蛋白质标准品,测定pH值,采用方差分析统计检验其均匀性;随机选取标准品,分别在不同温度(4、25、37℃)下放置不同时间(1、2、3和4周),各时间点取3支,酶联免疫法检测抗原含量,采用方差分析统计检验其稳定性。结果经协作标定,Vero细胞蛋白质标准品的标示量为2.6μg/mL,标准偏差为0.4,95%可信区间为2.51~2.78μg/mL。该批标准品的均匀性及稳定性良好。结论目前该Vero细胞蛋白质标准品已获批使用,批号为250022-201901,该标准品的建立,对提高人用狂犬病疫苗的质量控制具有重要意义。
- 李加石磊泰王玲刘晶晶张月兰王辉雷继军郭中平李玉华
- 关键词：VERO细胞标准品人用狂犬病疫苗
- 狂犬病病毒不同毒株的生物学特性研究被引量：8
- 2014年
- 目的研究狂犬病不同固定毒株对动物的致病性和对细胞的感染性。方法以小鼠脑内和肌内途径接种比较不同毒株的致病性,研究并建立HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸）诱导的空斑形成技术测定病毒空斑形成单位（plaque-forming unit,PFU）和细胞病变感染技术测定病毒感染滴度（CCID50）,并用以比较不同毒株的病毒滴度,实验同时以常规的直接免疫荧光法（direct immunofluorescent assay,dFA）做对照。结果不同固定毒株对10~12g小鼠的脑内致病力普遍很高,但肌内毒力普遍较低,脑腔感染致病力比肌内感染致病力高3.0~5.0lg LD50,CVS株相差最大为5.0lg LD50。用两种新的方法 （PFU和CCID50）测定不同毒株的病毒滴度与dFA法测定的结果比较,除个别株外无明显差异,如CVS-11、4aG、PV株用三种方法测定的滴度均在7.1~7.9lg。结论用dFA法测定病毒滴度的结果与小鼠脑内测定的结果有可比性,用以替代小鼠脑内法测定病毒滴度是可行的。两种细胞感染法测定的病毒滴度操作简便,无需贵重仪器和昂贵试剂,可以更广泛地应用于狂犬病病毒和疫苗发展的研究。
- 汤重发俞永新刘景华曹守春石磊泰李加吴小红王云鹏董关木李玉华
- 关键词：狂犬病病毒细胞病变
- RFFIT法血清系列参考品的建立
- 目的建立血清参考品,用于RFFIT法检测抗狂犬病毒中和抗体。方法狂犬病疫苗免疫后人血清,采用小鼠脑内中和试验确定抗狂犬病毒中和抗体滴度后,混匀,分装,以第二批人免疫球蛋白国际标准品为参考品用RFFIT方法进行标定,并考查...
- 吴小红李加
- 关键词：狂犬病毒
- 文献传递
- 狂犬病病毒核蛋白及糖蛋白在杆状病毒表达系统中的共表达及鉴定
- 2013年
- 目的利用杆状病毒表达系统共表达狂犬病病毒CTN-1V株核蛋白（nucleoprotein，NP）及糖蛋白（glycoprotein，GP）。方法RT-PCR分别扩增CTN．1V株病毒GP、NP编码区基因，分别依次克隆入转移质粒pFastBacDual的PⅢ区及P，。区构建杆状病毒重组转移质粒P—NG，转化DHl0BacE．coli感受态细胞获得重组穿梭质粒A-NG，转染Sf9细胞获得重组杆状病毒Bac-NG，高效表达目的蛋白NP、GP，进行Westernblot分析。结果重组杆状病毒穿梭质粒A-NG经PCR鉴定证明构建正确；狂犬病病毒NP、GP在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中获得正确表达，表达的重组蛋白NP、GP相对分子质量（Mr）约为51x10^3、59x10^-；表达的重组蛋白NP、GP均可与抗RV小鼠血清特异性结合。结论成功共表达狂犬病病毒CTN-1V株NP、GP，表达产物具有良好的抗原性，为狂犬病病毒基因工程疫苗及诊断试剂的研究奠定了基础。
- 李加曹守春石磊泰吴小红刘景华王云鹏邹剑俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒核蛋白糖蛋白杆状病毒表达系统
- 狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析被引量：1
- 2013年
- 对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。
- 李加曹守春石磊泰吴小红刘景华王云鹏唐建蓉俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒全基因组
- 金黄地鼠作为狂犬病暴露后疫苗免疫动物模型的应用被引量：4
- 2016年
- 目的以金黄地鼠作为动物模型,评价不同种类狂犬病疫苗在暴露后免疫中的保护效果。方法将不同类型狂犬病疫苗分别免疫两组金黄地鼠,一组为未感染过病毒的健康动物(Pr EP),另一组为感染过CVS株的动物(PEP),免疫后不同时间点通过心脏穿刺采血,RFFIT法测定血清抗体效价。对PEP组动物同时观察其死亡情况,分析各动物抗体水平与保护效果的相关性。另以4.0 lg MICLD_(50)/ml的CVS狂犬病固定毒株感染金黄地鼠左腿腓肠肌,每只0.2 ml,6 h后开始以不同类型狂犬病疫苗按0、3、7、14 d程序免疫,观察疫苗对动物的保护效果。结果暴露后免疫组(PEP)的血清抗体可在第4天出现阳性,第5天达100%,以后持续维持较高水平。未感染的暴露前免疫(Pr EP)动物的抗体水平从第4天开始一直较PEP组低。但PEP组中不同疫苗免疫的各动物中均观察到免疫后第4天及以后的抗体水平与最终该动物的发病死亡无相关性。高效价人用狂犬病疫苗的免疫保护率为80%,但疫苗原液分别稀释2倍和5倍后,保护率分别降至30%和20%。疫苗加PIKA佐剂作相同倍数稀释后,保护率可达80%,疫苗联合使用免疫球蛋白,暴露后保护率可达100%,未免疫的感染对照组动物的死亡率在90%左右。结论以金黄地鼠作为狂犬病暴露后免疫的动物模型可对不同质量疫苗作出有效评价。疫苗的效价与暴露后免疫中的保护作用有相关性,疫苗联合使用免疫球蛋白注射是最佳的暴露后免疫方案;PIKA佐剂在降低疫苗抗原量的同时提高了疫苗的保护作用;暴露后抗体水平未显示与保护效果具有相关性。
- 汤重发石磊泰俞永新李玉华曹守春李加吴小红王云鹏
- 关键词：狂犬病病毒金黄地鼠暴露后免疫佐剂体液免疫
- 首批Vero细胞蛋白质对照品的研制
- 2020年
- 目的建立首批Vero细胞蛋白质国家对照品,用于人用狂犬病疫苗Vero细胞宿主蛋白残留量检测试验的验证。方法本对照品系采用狂犬病病毒固定株接种Vero细胞,经培养、收获、浓缩、灭活病毒、纯化后,加入适量的人血白蛋白、右旋糖酐40冻干制成。本对照品蛋白含量溯源于Vero细胞蛋白质标准品(250022-201901),应用Vero细胞分泌型蛋白检测试剂盒(ELISA)对其进行标定后赋值。随机选取16支标准品,测定其pH值,采用方差分析统计检验均匀性;随机选取对照品,分别在4、25和37℃放置不同时间(1、2、3和4周),不同时间点取3支,以Vero细胞蛋白质标准品(250022-201901)绘制标准曲线,ELISA法测定蛋白含量,采用方差分析统计检验稳定性。结果经协作标定,本对照品标示量值为7.7μg/mL,参考范围为(7.7±3.6)μg/mL,均匀性及稳定性良好。结论Vero细胞蛋白质对照品已获批使用,批号为250023-201901,该对照品的建立,对加强人用狂犬病疫苗的质量控制具有重要意义。
- 李加石磊泰杨俊伟雷继军李玉华
- 关键词：VERO细胞对照品狂犬病疫苗
- 狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性的初步研究
- 2012年
- 目的构建狂犬病病毒糖蛋白基因DNA真核表达质粒，并检测其免疫原性。方法用RT—PCR法扩增和分离CTN株狂犬病病毒糖蛋白基因，测序后克隆至pcDNA5．0载体，构建重组质粒pcDNA5．0-G，提取质粒，转化293T细胞，检测糖蛋白瞬时表达，并以该重组质粒肌肉注射免疫BALB／c小鼠，狂犬病病毒CVS株攻击，观察小鼠存活情况。结果酶切、测序结果显示重组质粒pcDNA5．0-G构建成功，瞬时表达结果显示糖蛋白获得大量表达。经肌肉注射质粒常规免疫小鼠，病毒攻击后小鼠保护率为73．3％，对照组为6．7％。结论所构建狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒pcDNA5．0-G经肌肉注射免疫后可有效保护小鼠免受狂犬病病毒攻击，具有良好的免疫原性，这为后期核酸疫苗的研发奠定基础。
- 王云鹏曹守春李加刘景华石磊泰李玉华董关木
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白免疫原性
- 具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备及初步应用
- 2016年
- 目的：制备具有中和活性的抗狂犬病病毒的单克隆抗体。方法取灭活的狂犬病病毒CTN株免疫BALB/c小鼠,免疫方式采用0 d、7 d、14 d、28 d。之后取小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,获得杂交瘤细胞系,通过快速荧光抑制灶试验检测具有中和活性的阳性杂交瘤细胞系。取阳性杂交瘤细胞系腹腔注射BALB/c小鼠,采集腹水,通过亲和层析纯化获得具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体,进行抗体亚型鉴别和单克隆抗体可变区序列测序。最后,获得单克隆抗体后进行胶体金快速检测试纸条的建立。结果获得1株具有中和狂犬病病毒活性、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,标记为CTN-McAb1,收获小鼠腹水,并经纯化后获得具有中和活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体,纯度可达95%以上,抗体为IgG1亚型。成功制备人用狂犬病疫苗有效抗原检测胶体金试纸条。结论成功制备了1株具有中和狂犬病病毒活性的单克隆抗体并进行初步应用,这对人用狂犬病疫苗的质量控制具有较强的应用价值。
- 曹守春王云鹏李加石磊泰吴小红唐建蓉李玉华
- 关键词：狂犬病病毒单克隆抗体中和活性
- 人用狂犬病疫苗pH值质量分析
- 2023年
- 目的:了解人用狂犬病疫苗pH值质控现状,为做好人用狂犬病疫苗质量评价提供数据支持。方法:采用《中华人民共和国药典》三部pH值测定法,对国内15家企业人用狂犬病疫苗进行测定,每批疫苗测3次;对测得的结果进行趋势分析;并对人用狂犬病疫苗pH值质量控制进行讨论。结果与结论:测定结果显示,有14家企业的42批疫苗pH值在7.41~7.63,1家企业3批疫苗pH值在7.68~7.73;15家企业45批疫苗pH平均值为7.51,均在7.2~8.0的合格范围。不同病毒类疫苗的pH值标准各不相同,但对狂犬病毒而言,pH值在7.2~8.0之间能保持较好的生物学活性,因此适宜的pH值对维持狂犬病疫苗的安全、有效至关重要。
- 石磊泰曹守春李加王云鹏吴小红
- 关键词：人用狂犬病疫苗PH值温度
