戴剑漉
- 作品数：22 被引量：68H指数：5
- 供职机构：中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程轻工技术与工程更多>>
- 螺旋霉素生物合成基因簇中N,N-二甲基转移酶基因功能的鉴定
- 2022年
- 目的 确定螺旋霉素(SP)生物合成途径中编码两个N, N-二甲基转移酶的基因bsm9和bsm22的功能,并在基因阻断变株中分离纯化相应的SP前体物。方法 利用抗性基因插入或CRISPR-Cas基因编辑的方法阻断bsm9和bsm22基因,并对其进行基因回复实验。利用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用分析变株Δbsm9和Δbsm22的发酵产物。利用半制备液相色谱的方法分离纯化缺少甲基化修饰的SP前体物,经核磁共振波谱(NMR)数据分析确定其化学结构。结果 成功构建了两个基因的阻断株Δbsm9和Δbsm22。Δbsm9变株的发酵液没有抗菌活性的物质产生,经HPLC-MS分析也未发现相应的SP前体物。而Δbsm22变株的发酵产物的抗菌活性下降50%以上,从Δbsm22变株发酵产物中分离出福洛胺糖缺少两个甲基的SP前体物。结论 bsm22基因负责SP生物合成中福洛胺糖上的N, N-二甲基的催化,而bsm9基因可能参与麦洛胺糖的N, N-二甲基化修饰,且两者在功能上不能互补。
- 林茹李可萌刘娟娟戴剑漉赫卫清
- 关键词：螺旋霉素N基因阻断
- 生技霉素稳定型基因工程菌的构建
- 利用温敏型质粒载体,运用同源重组技术将异戊酰基转移酶基因整合至螺旋霉素产生菌Streptomyces.spiramyceticus F21的染色体上,构建了稳定的生技霉素基因工程菌WSJ-1.将WSJ-1在不加压的情况下...
- 尚广东王以光戴剑漉
- 关键词：同源重组基因工程菌
- 文献传递
- 麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素链霉菌F21中的酰化特性
- 2008年
- 螺旋霉素(SP)与麦迪霉素(MD)均为16元大环内酯类抗生素,并且结构非常相似。螺旋霉素含有3个组分,其结构差异表现在16元内酯环C3上的一个取代基的差异,SPI组分为羟基、SPII组分羟基乙酰化、SPIII组分羟基丙酰化;麦迪霉素是以麦迪霉素A1为主要组分的多组分抗生素,麦迪霉素16元内酯环C3上连接的均为丙酰化羟基。已知这类抗生素16元内酯环C3羟基酰化是由一种称为3-O-酰基转移酶的蛋白催化完成。本研究将螺旋霉素产生菌—Streptomyces spiramyceticus F21中的螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因用Streptomyces mycarofaciens ATCC 21454中的麦迪霉素3-O-酰基转移酶基因原位替换后,发现所产生的螺旋霉素仍然含有3个组分,并且螺旋霉素III组分也不是主要组分,说明麦迪霉素3-O-酰基转移酶在螺旋霉素产生菌—S.spiramyceticus F21中不具有16元内酯环C3羟基丙酰化特异性以及酰化高效性,也提示其在麦迪霉素产生菌中的丙酰化特异性和高效性可能与该菌株(种)的特性有关。
- 马春燕武临专戴剑漉周红霞李京艳孙晓春张侃夏焕章王以光
- 关键词：螺旋霉素麦迪霉素酰化
- 螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因的删除和主要产生螺旋霉素组分Ⅰ菌株的获得被引量：7
- 2007年
- 螺旋霉素(SP)为16元环大环内酯类抗生素,含有螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ个组分,其结构的差异为16元内酯环的C3上分别连接羟基(SPⅠ)、乙酰基(SPⅡ)和丙酰基(SPⅢ);SPⅡ和SPⅢ是在相同的3-O-酰基转移酶催化下SPⅠ进一步酰化的产物。SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ在生物学活性方面无大差异。为简化螺旋霉素组分,便于今后对其结构进行进一步改造,根据碳霉素和麦迪霉素生物合成中的3-O-酰基转移酶序列,设计了简并性PCR引物,并采用SON-PCR(single oligonucleotide nested PCR)方法,从螺旋霉素产生菌S.spiramyceticus F21中进行特异性扩增,获得了螺旋霉素3-O-酰基转移酶基因(sspA)及其侧翼序列,共约4.3kb(其中的3457nt DNA序列已被Genbank收录,DQ642742)。采用DNA同源双交换技术对S.spiramyceticus F21中的sspA进行了删除。对螺旋霉素原株和sspA缺失变株进行发酵产物提取和HPLC分析表明:原株中SPⅠ、SPⅡ和SPⅢ的相对含量分别为7.8%、67%和25%,变株中则分别为72%、18%和9.6%;变株主要组分为SPⅠ。螺旋霉素sspA缺失变株的获得为螺旋霉素组分简化及其衍生物的结构改造奠定了基础。
- 武临专马春燕王以光戴剑漉李京艳夏焕章
- 关键词：螺旋霉素基因删除
- 利用强启动子PermE^＊提高4＂-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4＂-异戊酰化水平被引量：8
- 2010年
- 目的提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导。方法构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力。结果在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍。结论在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平。
- 杨永红赫卫清李瑞芬戴剑漉杨劭王以光武临专
- 关键词：螺旋霉素生物转化必特螺旋霉素
- 响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基被引量：3
- 2010年
- 目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。
- 戴剑漉李瑞芬王以光武临专赫卫清
- 关键词：必特螺旋霉素响应面法培养基优化
- 螺旋链霉菌U-1941中PKSII型基因在淡青链霉菌tcmK变异株中的克隆(I)
- 2005年
- 利用螺旋霉素产生菌螺旋链霉菌(S trep tomy ces sp iramy ceticus U-1941)中发现的PK S II型基因,经测序和同源性比较证明在4174bp片段中含有PK S II型K S(K Sα)基因,该基因(pCG 4-K,aspA)由1229bp组成编码432个氨基酸,与产二素链霉菌A lpA和淡青链霉菌T cmK同源性分别为74.4%和69.7%。将含aspA基因的重组质粒pCG 4在四并菌素(tetracenom yc in C)产生菌(S.g laucescens GLA 4-26)tcmK基因缺陷型变异株中进行克隆,TLC分析表明转化子的发酵产物比对照株多一个明显的黄色斑点,该物质经分离、提纯后分析确定为一个含苯式结构的小分子化合物A S-5。
- 王以光戴剑漉李京艳孙桂芝陈目方
- 关键词：基因表达
- 提高可利霉素药代动力学研究中微生物法检测灵敏度的研究
- 目的 为进行可利霉素(原名必特螺旋霉素-BT)药代动力学研究,研究影响微生物法检测敏感度的因素,以提高血浆中测定BT 的灵敏度,为药代动力学研究中血药浓度的测定奠定基础.方法 采用管碟法和纸片法,考察检定菌液浓度、培养基...
- 戴剑漉赵小峰赫卫清贾晓宇李慧宁王以光
- 关键词：灵敏度
- 新一代必特螺旋霉素基因工程菌的微波诱变被引量：13
- 2009年
- 本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果。以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticusNBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选。辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;不加盖不冷却,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100和120 s。每次辐射5 s后,冰上快速冷却20 s再照射,并将照射时间累计。以不同的辐射时间设定为不同的微波处理剂量,计算致死率。结果表明,必特菌株对微波敏感,微波辐射60 s时致死率达到92.55%。微波诱变在以脉冲频率为2450MHz的800W家用微波炉条件下,其最佳作用方式为培养皿不加盖、冰上快速冷却,最佳辐射时间为50 s。初筛摇瓶正突变率达到57.14%,复筛摇瓶发酵效价是出发菌株1.6倍以上的有10株,占初筛菌株的2%。最终筛选得到突变株Streptomyces spiramyceticusNBT-UM22,其必特螺旋霉素发酵产量是出发菌株的1.87倍,且组分比例无明显变化。
- 戴剑漉李瑞芬武临专王以光
- 关键词：必特螺旋霉素微波诱变育种
- 提高可利霉素药代动力学研究中微生物法检测灵敏度的研究被引量：1
- 2013年
- 目的研究影响可利霉素微生物法检测敏感度的因素,以提高血浆中测定可利霉素的灵敏度,为药代动力学研究中血药浓度的测定奠定基础。方法采用管碟法和纸片法,以抑菌圈大小为指标,考察检定菌液浓度,培养基配方,单、双层培养基检定平板,缓冲液加NaCl,胎牛血清,血浆等多种因素对检测灵敏度的影响;采用有机溶剂从人血浆中萃取可利霉素等方法测定血药浓度。结果检定菌浓度、培养基配方、检定平板厚度对检测灵敏度影响显著,含NaCl的缓冲液有利于提高检测灵敏度,人血浆对检测灵敏度有一定影响。以藤黄八叠球菌作检定菌,其菌浓为OD600=0.3~1.0,采用含牛肉蛋白胨0.5%,牛肉浸膏0.25%检定培养基制备单层检定平板,可以有效提高可利霉素检测灵敏度6倍;从血浆中萃取可利霉素,用纸片法进行测定,其最低检测限度可达0.02μg/ml。结论所建立的从血浆中萃取可利霉素的纸片法显著提高了微生物法检测血浆中可利霉素的灵敏度,可用于可利霉素药代动力学研究中血药浓度的微生物法检测。
- 戴剑漉赵小峰赫卫清贾晓宇李慧宁王以光
- 关键词：微生物敏感性试验药代动力学
